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        破血化瘀湯治療急性腦內(nèi)血腫大鼠療效及其對(duì)VEGF、GAP-43影響的研究*

        2018-11-30 09:34:14周漢光張建黨張?jiān)?/span>曹阿丹
        陜西中醫(yī) 2018年12期
        關(guān)鍵詞:含藥湯劑空白對(duì)照

        周漢光,張建黨,張?jiān)?,曹阿?/p>

        1.河南省南陽(yáng)市中心醫(yī)院神經(jīng)外科(南陽(yáng) 473000),2.河南科技大學(xué)第二附屬醫(yī)院影像科 (洛陽(yáng) 471000)

        主題詞 血腫 @破血化瘀湯 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 大鼠

        隨著社會(huì)水平的提高和交通運(yùn)輸業(yè)的發(fā)展,外傷造成的顱腦損傷發(fā)生率僅次于四肢傷,在全身?yè)p傷中高達(dá)15%,其中以腦內(nèi)血腫最為常見(jiàn)[1-2]。急性腦內(nèi)血腫是指腦實(shí)質(zhì)內(nèi)的血腫,可發(fā)生在腦組織的任何部位,好發(fā)于額葉及顳葉前端,占總數(shù)的80%,其次是頂葉和枕葉約占10%左右,其余則分別位于腦深部、腦基底節(jié)、腦干及小腦內(nèi)等處[3-5]。顱腦損傷后,血腫迅速形成,隨著出血繼續(xù),血腫不斷擴(kuò)大,進(jìn)而推移、壓迫腦組織,導(dǎo)致顱內(nèi)壓升高和腦疝形成,從而引發(fā)一系列臨床癥狀[6]。該病具有損傷部位嚴(yán)重、發(fā)病迅速、預(yù)后不良的特點(diǎn)。西醫(yī)對(duì)腦出血的治療主要采取保守的內(nèi)科治療,如脫水降顱內(nèi)壓,控制水腫,調(diào)整血壓等,大劑量出血采取手術(shù)消除血腫,而中醫(yī)藥對(duì)本病在預(yù)防治療和康復(fù)方面有良好的療效與優(yōu)勢(shì)。中醫(yī)理論中提出“離經(jīng)之血便是瘀”一說(shuō),所以對(duì)急性腦出血提出了破血化瘀的治療法則,臨床上取得了較好的療效,但是對(duì)其作用機(jī)制的研究尚缺乏理論支持,有必要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)是目前發(fā)現(xiàn)的刺激血管生成的因子之一,腦出血后血管再生是其治療的關(guān)鍵所在,而VEGF是一種特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的多功能因子,其在急性腦出血恢復(fù)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[7]。生長(zhǎng)相關(guān)蛋白-43(Growth associated protein,GAP-43)對(duì)神經(jīng)的生長(zhǎng)、發(fā)育、再生及突觸功能的維持和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用,是神經(jīng)再塑、再生的分子標(biāo)志物[8]。本實(shí)驗(yàn)主要是觀察以破血化瘀的中藥湯劑對(duì)急性腦內(nèi)血腫大鼠的治療效果及其對(duì)VEGF和GAP-43表達(dá)的影響。

        材料與方法

        1 材 料

        1.2 試 劑:人VEGF ELSIA試劑盒;Re-vertaidTMFirst Strand cDNA Synthesis試劑盒;GIBCOTM M199培養(yǎng)基干粉,引物;AEC顯色試劑盒;Ultra Sensitive TM S-P試劑盒; Boyden小室;鼠抗人VEGF、兔抗人VEG-FR2、AEC水性封片劑;recom-binant Taq酶(1U/μl),dNTPs(10 mmol/L);3%戊巴比妥鈉,4%多聚甲醛溶液,明膠,10%水合氯醛。

        1.3 設(shè) 備:顯微鏡(日本,Olympus公司); 顯微圖像分析Motic Images 2000 1.3、數(shù)碼成像系統(tǒng); 凝膠成像系統(tǒng)及配套軟件 Quantity One(美國(guó),BIO-RAD公司);PE9600基因擴(kuò)增儀(美國(guó),PE公司);全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó),BioTek公司);電泳儀(美國(guó),BIO-RAD公司);電冰箱。其他使用器械:靜脈留置套管針、棉簽、棉球、醫(yī)用膠布、一次性醫(yī)用橡膠手套、止血鉗、彎鉤鉗、醫(yī)用手術(shù)縫合針、玻璃分針、持針器、眼科剪、器械盤(pán)、手術(shù)刀、手術(shù)縫合線等。

        1.4 動(dòng) 物:SD大鼠,6周齡,體重(150±20) g,雌雄各半,SPF級(jí),由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

        2 方 法

        2.1 動(dòng)物模型的建立、分組及給藥:采用隨機(jī)數(shù)字表將大鼠,隨機(jī)分為破血化瘀湯組和空白對(duì)照組,每組20只。兩組以7 d連續(xù)灌胃給藥形式,一組以15 g/kg破血化瘀湯劑量,另一組則給予等量生理鹽水,2次/d,共14次,第8天注射3%戊巴比妥鈉麻醉后,腹主動(dòng)脈采血,靜置、離心、滅活處理之后,分離血清,收集上層血漿,低溫保存。

        2.2 ELSIA檢測(cè)VEGF含量:依照人VEGF ELSIA試劑盒說(shuō)明書(shū),吸取各組經(jīng)藥物處理48 h后的細(xì)胞培養(yǎng)上清液,進(jìn)行檢測(cè)。

        2.3 免疫組化及PCR檢測(cè)VEGF含量:將2 ml細(xì)胞懸液接種在置于10 cm2培養(yǎng)皿經(jīng)預(yù)處理的蓋玻片,取出經(jīng)48 h后藥物處理的蓋玻片,經(jīng)過(guò)磷酸緩沖液(PBS)清洗,固定10 min的中性甲醛,經(jīng)過(guò)透膜處理20 min以后,采用常規(guī)免疫組化對(duì)照檢測(cè)VEGF,選鼠抗人VEGF單克隆抗體為一抗,另一抗以PBS作陰性對(duì)照。應(yīng)用Motic Images 2000 1.3采集圖像及顯微圖像對(duì)VEGF免疫組化圖片進(jìn)行對(duì)照分析,蛋白的相對(duì)含量則采用平均灰度值來(lái)間接表示,與陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物成相反趨勢(shì),蛋白含量越少,陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物越深,平均灰度值越小。分別對(duì)5 d、10 d、15 d的各組大鼠進(jìn)行免疫組織染色,經(jīng)10%水合氯醛(3.5 ml/kg體重)腹腔注射、麻醉,灌注破血化瘀湯劑,取腦組織。用4%多聚甲醛溶液固定24 h,常規(guī)石蠟制作石蠟切片染色,將明顯血腫切片選出,留用分析。對(duì)選出的切片進(jìn)行室溫脫蠟,在3% H2O2溶液中靜置10 min,經(jīng)過(guò)蒸餾水和磷酸緩沖液(PBS)沖洗6 min,再將切片浸于枸椽酸鹽緩沖液(PH6)中,每隔10 min后微波修復(fù) 5 min。自然冷卻至室溫后,滴加一抗(GAP-43),于4℃冰箱孵育12 h。切片由磷酸緩沖液(PBS)沖洗6 min,甩干后滴加相應(yīng)二抗,于恒溫箱(37℃)中孵育30 min,PBS再?zèng)_洗6 min。二氨基聯(lián)苯胺法(DAB)顯色5~10 min,注意控制染色深度,沖洗后,蘇木素復(fù)染1~2 min,再?zèng)_洗,脫水封片。隨機(jī)選取各時(shí)間點(diǎn)每組各標(biāo)本于血腫區(qū)周?chē)?個(gè)視野,采用高倍鏡( ×400)進(jìn)行觀察, 再利用Motic 3000數(shù)碼成像系統(tǒng),計(jì)算平均每個(gè)視野內(nèi)GAP-43的陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)。每組GAP-43陽(yáng)性蛋白細(xì)胞數(shù)以120個(gè)視野的平均值。

        2.4 治療效果評(píng)價(jià):分別將3種不同濃度的破血化瘀湯劑組與同血清含量的空白對(duì)照對(duì)比,觀察不同濃度的破血化瘀湯劑較同血清含量的空白對(duì)照組對(duì)VEGF水平的影響、對(duì)VEGF表達(dá)的影響、VEGF受體的影響;觀察造模后的第5天、第10天、第15天破血化瘀湯組與空白組相比對(duì)大鼠腦組織GAP-43蛋白表達(dá)的影響。

        結(jié) 果

        1 破血化瘀湯劑對(duì)VEGF水平的影響 分別將3種不同濃度的破血化瘀湯劑組與同血清含量的空白對(duì)照組對(duì)比,從VEGF ELISA 檢測(cè)結(jié)果(圖1)發(fā)現(xiàn),2.5%含藥血清與2.5%空白對(duì)照組相比能顯著提高血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF的含量(P<0.05),說(shuō)明該濃度的含藥血清能夠顯著促進(jìn)VEGF的分泌;而其余濃度的含藥血清對(duì)VEGF的作用不是十分顯著。

        2 破血化瘀湯劑對(duì)VEGF表達(dá)的影響 Motic 3000處理免疫組化照片的圖像分析結(jié)果(圖1)顯示,與同血清含量的空白對(duì)照相比,2.5%含藥血清組的VEGF灰度值最小,表明該組細(xì)胞內(nèi)VEGF相對(duì)含量最高,同時(shí)也能顯著促進(jìn)VEGF的合成(P<0.05),另外兩種藥物濃度對(duì)VEGF的含量水平與合成均無(wú)顯著影響。

        3 破血化瘀湯劑對(duì)VEGF受體的影響 RT-PCR的檢測(cè)結(jié)果(表2,圖1)顯示,分別將3種不同濃度的破血化瘀湯劑組與同血清含量的空白對(duì)照相比,2.5%含藥血清與2.5%的空白對(duì)照組相比,血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF含量、及其受體的轉(zhuǎn)錄水平(P<0.05)二者都顯著提高;而較高濃度5%含藥血清與5%的空白對(duì)照組相比,5%含藥血清對(duì)VEGF本身的轉(zhuǎn)錄有影響;而對(duì)VEGF及其受體的表達(dá)均無(wú)顯著影響是較低濃度1.25%含藥血清。

        表1 破血化瘀湯對(duì)VEGF表達(dá)的影響

        注:A-C依次為1.25%,2.5%,5%破血化瘀湯劑血清;D-F依次為1.25%,2.5%,5%空白血清

        圖1 RT-PCR 檢測(cè) VEGF mRNA 表達(dá)結(jié)果

        4 破血化瘀湯劑對(duì)大鼠腦組織GAP-43蛋白表達(dá)的影響 高倍鏡下大鼠腦組織GAP-43陽(yáng)性細(xì)胞,顏色呈淡黃色或棕黃色,主要表達(dá)于血腫區(qū)神經(jīng)元胞質(zhì)中,膠質(zhì)細(xì)胞僅有少量表達(dá)。造模后的第5天,各破血化瘀GAP-43均有表達(dá),隨時(shí)間增加表達(dá)也隨之增加,在第10天后,開(kāi)始有不同程度下降。與空白組相比,破血化瘀湯組第10天、15 天的GAP—43陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

        表2 各時(shí)間點(diǎn)各組大鼠腦組織GAP-43陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較

        討 論

        急性腦內(nèi)血腫是指由于外傷導(dǎo)致顱內(nèi)出血,隨著出血加重,血腫迅速形成,并在72 h內(nèi)造成顱內(nèi)壓升高或者腦疝形成[9-10]。腦內(nèi)血腫常發(fā)生的部位大致在硬膜外、硬膜下及腦內(nèi)三類,不同的損傷部位,患者的病情程度也不同。硬膜外血腫受損程度較輕,患者在昏迷之間伴隨清醒;硬膜下血腫相對(duì)之下,昏迷發(fā)生快、昏迷時(shí)間持續(xù)長(zhǎng)、顱內(nèi)壓突發(fā)升高,不易控制;腦內(nèi)血腫患者的腦實(shí)質(zhì)受損較為嚴(yán)重,由輕度昏迷轉(zhuǎn)變深度昏迷,支配重要功能的部位易被血腫壓迫,預(yù)后較差[11-14]。若臨床恢復(fù)期除了采取一般的西醫(yī)治療以外,配合使用適宜的中藥湯劑,對(duì)癥治療,能夠盡快幫助患者預(yù)后恢復(fù),早日返回日常生活當(dāng)中。

        本實(shí)驗(yàn)中VEGF ELISA 檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),2.5%含藥血清與2.5%空白對(duì)照組相比能顯著提高血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF的含量,說(shuō)明該濃度的含藥血清能夠顯著促進(jìn)VEGF的分泌;而1.25%和5%的含藥血清對(duì)VEGF的作用不是十分顯著。而圖像分析結(jié)果顯示,與同血清含量的空白對(duì)照相比,2.5%含藥血清組細(xì)胞內(nèi)VEGF相對(duì)含量最高,能顯著促進(jìn)VEGF的合成,而另外兩種藥物濃度對(duì)VEGF的含量與合成均無(wú)顯著影響。RT-PCR的檢測(cè)結(jié)果顯示2.5%含藥血清與2.5%的空白對(duì)照組相比,血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF含量、及其受體的轉(zhuǎn)錄水平都顯著提高;而較高濃度5%含藥血清與5%的空白對(duì)照組相比,5%含藥血清對(duì)VEGF本身的轉(zhuǎn)錄有影響,而對(duì)VEGF及其受體的表達(dá)均無(wú)顯著影響是較低濃度1.25%含藥血清。表明破血化瘀湯劑可以促進(jìn)腦內(nèi)血管內(nèi)皮的生長(zhǎng)因子VEGF,不同藥物濃度對(duì) VEGF的影響也不同,灌胃給藥10 d后的正常大鼠,血清中VEGF含量明顯升高,同時(shí),僅2.5%濃度含藥血清能顯著促進(jìn)VEGF的合成。

        正常生理狀態(tài)下,生長(zhǎng)相關(guān)蛋白-43(Growth associated protein,GAP-43)處于低水平,而當(dāng)腦神經(jīng)損傷時(shí), GAP-43表達(dá)的增高是內(nèi)源性神經(jīng)再生的顯著特征[15]。因此, GAP-43可以用來(lái)標(biāo)記神經(jīng)元發(fā)育生長(zhǎng)、神經(jīng)再生以及成熟中樞神經(jīng)系統(tǒng)中突觸重建。故GAP-43高表達(dá)是在腦組織因缺血、缺氧,激活神經(jīng)纖維發(fā)芽、突觸重建的神經(jīng)再生的過(guò)程[16]。實(shí)驗(yàn)中,GAP-43在腦血腫后第5天就開(kāi)始表達(dá),至第10天逐漸降低,表明破血化瘀湯劑可以有效提高腦血腫大鼠腦組織GAP-43陽(yáng)性表達(dá),并延緩其下降,從而促進(jìn)腦缺血后神經(jīng)的再生,增加中樞神經(jīng)系統(tǒng)的修復(fù)能力。

        總之,破血化瘀湯劑有助于促進(jìn)急性腦內(nèi)血腫血管內(nèi)皮VEGF的生長(zhǎng)以及利于大腦神經(jīng)元神經(jīng)GAP-43再生。

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