張世嬌，王娜梅，王慧霞

河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院(鄭州 450003)

主題詞 抑郁癥，產(chǎn)后 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 大鼠

隨著不斷加快的生活節(jié)奏、加大的工作壓力，產(chǎn)后抑郁癥(PPD)患病率呈逐年上升趨勢(shì)[1-2]。有報(bào)道稱世界衛(wèi)生組織數(shù)據(jù)顯示，抑郁癥已成為影響人類生活的第二大疾病[3]。祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為抑郁最開始是氣滯，后出現(xiàn)痰結(jié)、食滯、火郁及血瘀等，產(chǎn)婦“多虛多瘀”，病情日久不愈，影響氣血陰陽(yáng)，導(dǎo)致肝、脾、腎等重要臟器的病變。本病治則主以疏肝健脾，根據(jù)此法制成“逍遙合劑”，具有疏肝健脾養(yǎng)血等功效。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，抑郁癥與多種神經(jīng)遞質(zhì)存在一定的相關(guān)性[4]。已有研究證實(shí)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)信號(hào)通路是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)的其中一條，與抑郁癥有密切聯(lián)系，起重要作用，越來越受到研究學(xué)者的關(guān)注[5]。因此，本次研究針對(duì)產(chǎn)后抑郁“肝郁脾虛”病證，提出“疏肝健脾法”治療產(chǎn)后抑郁。本次研究以ERK1/2通路為切入點(diǎn)，探討逍遙合劑對(duì)產(chǎn)后抑郁癥模型大鼠行為學(xué)、神經(jīng)遞質(zhì)的作用。

材料與方法

1 材 料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)正常SD雌性大鼠72只，5～6周齡，體重160～180 g，均購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物合格證編號(hào)：SCXK(滬) 20140125。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均飼養(yǎng)于本院(25±2)℃的屏障實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，每12 h光照明暗交替，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)過本院醫(yī)院倫理委員會(huì)審核，倫理編號(hào)： AESI-2016-0325，實(shí)驗(yàn)研究均符合中國(guó)倫理委員會(huì)中關(guān)于動(dòng)物研究原則。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及試劑：逍遙合劑(主要藥物：柴胡、白芍、茯苓各20 g，當(dāng)歸、生姜各15 g，薄荷、大棗各10 g,本院院內(nèi)制劑)，鹽酸氟西汀(國(guó)藥準(zhǔn)字：H41012925，批號(hào)：20160821)，苯甲酸雌二醇注射液(國(guó)藥準(zhǔn)字：H42032116，批號(hào)：20160516)，黃體酮注射液(國(guó)藥準(zhǔn)字：H71022318，批號(hào)：20160623)，MEK1一抗及p-MEK1一抗(國(guó)藥準(zhǔn)字：H62012423，H56023146;批號(hào)：ab31034，ab8621)。

1.3 實(shí)驗(yàn)主要儀器：X射線膠片洗片機(jī)(購(gòu)買于德國(guó)Protec公司)；Mini-protean型小型垂直電泳槽及M2000 多功能酶標(biāo)儀(購(gòu)買于美國(guó)Bio-Rad公司)；CKX31倒置顯微鏡(購(gòu)買于日本 Olympus 公司)；CHOL16M高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(購(gòu)買于湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司)；YP601N 型電子天平(購(gòu)買于上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

2 方 法

2.1 分組:SD雌性大鼠喂養(yǎng)1周，采用隨機(jī)數(shù)字表法分6組，分別為：正常組、模型組、逍遙合劑高、中、低劑量組、陽(yáng)性藥組，每組12 只。

2.2 造模與給藥：大鼠均進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)，按體重隨機(jī)分正常及模型組。模型組實(shí)行切除兩側(cè)卵巢手術(shù)，術(shù)后2～5 d行陰道細(xì)胞學(xué)涂片檢查，5 d后將大鼠造模。具體造模：連續(xù)16 d在大鼠皮下注射苯甲酸雌二醇0.1 ml、黃體酮0.2 ml，后連續(xù)7 d注射雌二醇0.1 ml，23 d后停止注射，造模動(dòng)物出現(xiàn)抑郁癥狀。造模成功后，按曠場(chǎng)隨機(jī)分6組，正常組、模型組予灌注生理鹽水，逍遙合劑高、中、低劑量組的7、3.6、1.8g(kg·d)，相當(dāng)60 kg成人體重臨床等效量、陽(yáng)性藥組即鹽酸氟西汀組10 mg(kg·d)，各組均 1次/d，連續(xù)灌胃治療21 d。

2.3 體重指標(biāo)：在實(shí)驗(yàn)開始后的每周三測(cè)量大鼠體重，并詳細(xì)記錄。

2.4 行為學(xué)指標(biāo)：采用敞箱(Open-Field)行為評(píng)分，具體操作如下：將大鼠放置于黑色長(zhǎng)方體內(nèi)，將敞箱劃分9塊。在敞箱上懸掛攝像頭，用以記錄動(dòng)物日?；顒?dòng)，水平得分：活動(dòng)總路程；探索得分：中央?yún)^(qū)域活動(dòng)路程。每只動(dòng)物測(cè)定1次，每次5 min。

2.5 神經(jīng)遞質(zhì)：給藥治療21 d后將大鼠腹腔注射麻醉處死，開顱，將下丘腦分離，液氮儲(chǔ)存。制備下丘腦標(biāo)本：從液氮中取出下丘腦后置于4 ℃冰箱解凍，稱300 mg，放置研磨器與生理鹽水混合，避光，后轉(zhuǎn)移至2 mlEP管，離心15 min，取上清液測(cè)定下丘腦中5-HT、NE、DA含量，按ELISA試劑盒說明書要求操作。

2.6 下丘腦中MEK1及p-MEK1蛋白測(cè)定：取大鼠下丘腦，液氮研磨，置裂解液中，提取總蛋白，測(cè)定蛋白濃度，計(jì)算蛋白量上樣，并配制凝膠。電泳后將其轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，封閉1 h，加入一抗，放置4℃搖床過夜，并洗膜，加二抗孵育1 h，洗膜，HRP顯色，選用Image-Pro plus圖像分析軟件測(cè)條帶灰度值。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)計(jì)量資料進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，各組間比較，采用單因素方差分析(ANOVA檢驗(yàn))，采用LSD-t和Dunnett T3檢驗(yàn)方法，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 體 重 3周后，各治療組大鼠體重均高于模型組體重，且正常組、逍遙合劑高、中劑量組顯著高于模型組(P<0.05)，逍遙合劑高劑量組體重顯著高于鹽酸氟西汀組(P<0.05)，見表1。

注：各組與模型組比較，△P<0.05，與逍遙合劑高劑量組比較，▲P<0.05

2 行為學(xué)評(píng)分測(cè)定 治療前，各治療組大鼠行為學(xué)指標(biāo)評(píng)分均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，治療后逍遙合劑高、中劑量組及鹽酸氟西汀組的水平移動(dòng)總路程較模型組有顯著差異(P<0.05)，逍遙合劑高、中、低劑量組及鹽酸氟西汀組的中央?yún)^(qū)域路程較模型組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，見表2。

表2 各組行為學(xué)評(píng)分比較(m)

注：各組與模型組比較，△P<0.05，與高劑量組比較，▲P<0.05

3 各組大鼠治療21 d下丘腦5-HT、DA、NE水平比較 逍遙合劑高、中劑量組5-HT、DA、NE水平較模型組顯著上升(P<0.05)，見表3。

表3 各組大鼠治療21d下丘腦5-HT、DA、NE水平比較

注：各組與模型組比較，△P<0.05，與高劑量組比較，▲P<0.05

4 下丘腦中p-CREB、p-ERK1/2蛋白測(cè)定 逍遙合劑高、中劑量組p-CREB、p-ERK1/2蛋白水平較模型組顯著上升(P<0.05)，逍遙合劑低劑量組及鹽酸氟西汀組較逍遙合劑高劑量組顯著降低(P<0.05)，見表4。

表4 各組大鼠治療21 d下丘腦中p-CREB、p-ERK1/2蛋白比較

注：各組與模型組比較，△P<0.05，與逍遙合劑高劑量組比較，▲P<0.05

討 論

PPD與典型的抑郁癥有所不同，該病的主要臨床表現(xiàn)發(fā)生在產(chǎn)褥期，以焦慮、激動(dòng)、不安、失眠、恐懼等為癥狀[6]。該病發(fā)生是由多個(gè)方面綜合作用的結(jié)果，如生理、環(huán)境、心理、壓力等。產(chǎn)后抑郁動(dòng)物實(shí)驗(yàn)主要以雌鼠行雙側(cè)卵巢切除后，并注射雌孕激素，以此來進(jìn)行妊娠的模擬[7]，在停止給藥后，激素水平將發(fā)生較快的下降，后根據(jù)大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的得分情況來判斷模型是否構(gòu)建成功[8-9]。有研究顯示，ERK1/2通路是MAPK的其中一條，ERK的信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制主要有反饋調(diào)節(jié)、支架蛋白、亞細(xì)胞、G蛋白等[10-11]。有研究認(rèn)為：其信號(hào)通路主要表現(xiàn)在雌激素激活BDNF受體酪氨酸激酶B，并激活小分子G蛋白,從而活化 MAPK激酶及ERK1/2，與此同時(shí)，核糖體S6激酶也得到相應(yīng)的激活，環(huán)磷腺苷反應(yīng)元結(jié)合蛋白促使其磷酸化，基因轉(zhuǎn)錄得到調(diào)控，以此來改善產(chǎn)婦抑郁癥狀[12-13]。有學(xué)者認(rèn)為抑郁與下丘腦中的蛋白水平表達(dá)量存在密切的相關(guān)性[14]，因此本文以ERK1/2 通路中p-CREB、p-ERK1/2的蛋白水平進(jìn)行探討。產(chǎn)后抑郁多考慮“肝郁脾虛”，本次研究針對(duì)“肝郁脾虛”病證，提出“疏肝健脾法”用于產(chǎn)后抑郁的治療。而中藥復(fù)方逍遙合劑(主要藥物組成：柴胡、白芍、茯苓各20 g，當(dāng)歸、生姜各15 g，薄荷、大棗各10 g)符合此治療原則。柴胡疏肝解郁，現(xiàn)代藥理學(xué)認(rèn)為柴胡總皂甙能使肝糖無明顯增加，能抑制腎上腺素，誘導(dǎo)脂肪分解，降低脂肪量；芍藥總苷可清除氧自由基，抑制肝臟脂質(zhì)過氧化，當(dāng)歸、白芍養(yǎng)血柔肝，茯苓健脾安神，生姜溫胃和中，大棗溫以補(bǔ)脾經(jīng)不足，甘以緩肝急。全方共奏疏肝、健脾之功，藥物相得益彰。

本研究各治療組大鼠體重均高于模型組體重，且正常組、逍遙合劑高、中劑量組顯著高于模型組，逍遙合劑高劑量組體重顯著高于鹽酸氟西汀組，表明逍遙合劑在一定程度上有恢復(fù)體重的療效，且呈現(xiàn)出一定的劑量關(guān)系。治療后，逍遙合劑高、中劑量組及鹽酸氟西汀組的水平移動(dòng)總路程較模型組有顯著差異，逍遙合劑高、中、低劑量組及鹽酸氟西汀組的中央?yún)^(qū)域路程較模型組有顯著差異。結(jié)果顯示模型組大鼠獲得的Open-Field得分有一定程度的下降，表明PDD模型有活動(dòng)度的降低，這與醫(yī)護(hù)人員在臨床上所見PDD患者癥狀基本相一致。而逍遙合劑高、中劑量組可顯著改善PDD模型大鼠的行為學(xué)，有臨床利用價(jià)值。逍遙合劑高、中劑量組5-HT、DA、NE水平較模型組顯著上升。有研究認(rèn)為抑郁癥與神經(jīng)遞質(zhì)存在密切聯(lián)系，神經(jīng)遞質(zhì)濃度不足，引起患者精神及心理功能有所下降[15-17]。而本次結(jié)果表明逍遙合劑高、中劑量組具有抗抑郁作用，能緩解由于PDD引起的異常神經(jīng)遞質(zhì)分泌。逍遙合劑高、中劑量組p-CREB、p-ERK1/2蛋白水平較模型組顯著上升，逍遙合劑低劑量組及鹽酸氟西汀組較逍遙合劑高劑量組顯著降低。在本文中，產(chǎn)后抑郁模型的p-CREB、p-ERK1/2含量顯著降低。而逍遙合劑高、中劑量組可顯著提高抑郁大鼠p-CREB、p-ERK1/2的水平。推測(cè)可能是由于將模型大鼠的卵巢切除后，其體內(nèi)的雌激素降低，使其反應(yīng)元件減弱，下調(diào)BDNF及TrKB分子蛋白，最后使MEK1活化降低，發(fā)生抑郁[18]。在予逍遙合劑高、中、低劑量及鹽酸氟西汀治療后，其指標(biāo)顯著上升，均有改善，表現(xiàn)出陽(yáng)性結(jié)果，但都較正常組降低。該結(jié)果在一定程度上表明對(duì)于產(chǎn)后抑郁，采用疏肝健脾法治療，結(jié)合于BDNF的反應(yīng)元件，激活ERK1/2 信號(hào)上的蛋白，產(chǎn)生效應(yīng)，改善抑郁癥狀，表明逍遙合劑可能通過ERK1/2通路來調(diào)控并改善抑郁。

綜上所述，逍遙合劑能有效改善產(chǎn)后抑郁模型大鼠行為學(xué)各項(xiàng)指標(biāo)，可能是通過上調(diào)下丘腦神經(jīng)遞質(zhì)及ERK1/2信號(hào)通路上p-MEK1、MEK1蛋白水平來緩解抑郁癥狀。