宋華杰，王 婷，李 珍，王晶鈺，齊雪峰

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，楊凌 712100)

小反芻獸疫(Peste des petits ruminants，PPR)是由小反芻獸疫病毒(Peste des petits ruminants virus，PPRV)引起山羊、綿羊及野生小反芻獸的一種急性、烈性、接觸性動(dòng)物傳染病。該病至今依然是世界范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅動(dòng)物健康養(yǎng)殖的重大疫病之一。PPRV對(duì)淋巴細(xì)胞和上皮細(xì)胞具有較強(qiáng)噬性，其感染宿主后造成機(jī)體免疫抑制是其致病的主要特征[1]。雖然目前對(duì)于PPRV已經(jīng)做了很多有價(jià)值的研究工作，但關(guān)于該病毒對(duì)山羊致病機(jī)制研究仍不十分明了。淋巴細(xì)胞信號(hào)活化分子(signaling lymphocyte activation molecule，SLAM)表達(dá)于多種哺乳動(dòng)物淋巴細(xì)胞、樹突細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等，是PPRV等麻疹病毒屬病毒在淋巴細(xì)胞的主要受體[2-6]。山羊的外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)被廣泛用于小反芻獸疫病毒致免疫抑制相關(guān)研究。研究表明，山羊PBMCs中SLAM受體表達(dá)水平與PPRV的增殖水平密切相關(guān)[4,7]，而有關(guān)SLAM受體表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)制及其在PPRV感染與復(fù)制中的具體作用尚不完全清楚。

近年來，越來越多的證據(jù)表明宿主細(xì)胞小RNA(miRNA)是機(jī)體先天性/獲得性免疫以及宿主-病原體相互作用的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)中不可或缺的調(diào)節(jié)因子，其在抗病毒感染和復(fù)制方面發(fā)揮著重要作用[8-10]。Novel_miR218是本實(shí)驗(yàn)室在山羊PBMCs中新發(fā)現(xiàn)的一種微小核糖核酸分子，基于RNAhybrid及miRanda等生物信息學(xué)分析表明SLAM是novel_miR218的潛在靶基因，但關(guān)于novel_miR218對(duì)山羊PBMCs中SLAM表達(dá)水平調(diào)節(jié)機(jī)制尚需進(jìn)一步證實(shí)。

本研究旨在研究novel_miR218在PPRV感染山羊PBMCs中對(duì)SLAM受體表達(dá)水平的調(diào)節(jié)作用及其對(duì)病毒增殖的影響，研究結(jié)果對(duì)進(jìn)一步闡明PPRV在羊源細(xì)胞中的復(fù)制及其致病機(jī)制具有重要的理論意義和潛在的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 病毒及細(xì)胞

所用PPRV標(biāo)準(zhǔn)疫苗毒株N75-1為筆者實(shí)驗(yàn)室保存，病毒在Vero細(xì)胞上增殖，滴度是105.65TCID50·mL-1；山羊PBMCs從西北農(nóng)林科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心18月齡健康莎能奶山羊頸靜脈處無菌采血，隨后用淋巴細(xì)胞分離液分離獲得，通過含有100單位的青霉素、100 μg·mL-1的鏈霉素和10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2 主要試劑

DMEM/F-12為Gibco產(chǎn)品；胎牛血清為Hyclone產(chǎn)品；胰蛋白酶為Amresco產(chǎn)品；Lipofectamine RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑、RNA酶抑制劑和TRIzol RNA試劑盒均為Invitrogen公司產(chǎn)品；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和miRNA定量試劑盒均為廣州銳博生物科技有限公司產(chǎn)品；鼠抗SLAM單克隆抗體、兔抗β-actin抗體、HRP-羊抗兔IgG和HRP-羊抗鼠IgG均購(gòu)自Invitrogen公司；鼠抗PPRV N蛋白抗體由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

參照NCBI公布的山羊SLAM基因序列設(shè)計(jì)引物，其正向引物序列：5′-AACTGGAGTGAGGAAGCAGGT-3′，反向引物序列：5′-CGCAATGCAGATGTAGACGTT-3′；內(nèi)參β-actin的正向引物序列：5′-GCATTGCCCTCAACGACCACTTTGTC-3′，反向引物序列：5′-CTCCTTGGAGGCCATGTGGACCATG-3′。Novel_miR218序列信息為5′-CUCCCAGCGCUGUCACCAC-3′，其定量PCR引物序列購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司(產(chǎn)品編號(hào):miR8003168、miR8003167)。

1.4 Novel_miR218 mimic及inhibitor序列

Novel_miR218模擬物(novel_miR218 mimic)、novel_miR218拮抗物(novel_miR218 inhibitor)均購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司(產(chǎn)品編號(hào):miR1170901031458、miR2170901031600)。

1.5 病毒感染

山羊PBMCs分離后在5%CO2濃度的培養(yǎng)箱、10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)16 h。未貼壁的山羊PBMCs在病毒接種前用RPMI 1640培養(yǎng)基輕輕洗去。之后用MOI=1的PPRV N75-1株病毒接種山羊PBMCs，同時(shí)設(shè)置未感染對(duì)照，于感染后24 h(hpi)收樣。感染組和未感染對(duì)照組均設(shè)置3個(gè)獨(dú)立的生物學(xué)重復(fù)。

1.6 RNA的提取和熒光定量PCR

用TRIzol reagent處理各組PBMCs后提取總RNA，Nanodrop2000超微量分光光度計(jì)定量，用cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用SYBR GreenⅠ法進(jìn)行qRT-PCR，每組3個(gè)重復(fù)，檢測(cè)PPRV感染山羊PBMCs中SLAMmRNA和novel_miR218的表達(dá)水平變化。SLAMmRNA和novel_miR218檢測(cè)分別以β-actin和5S為內(nèi)參基因，2-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量計(jì)算，每個(gè)樣品重復(fù)3次求平均值。

1.7 Western blot檢測(cè)

將作用不同時(shí)間段的各組細(xì)胞用RIPA裂解后進(jìn)行SDS-PAGE，然后將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別用SLAM抗體、PPRV N蛋白抗體、β-actin抗體在4 ℃孵育過夜，TBST洗膜4次，二抗孵育1 h，TBST洗膜6次，加入化學(xué)發(fā)光劑ECL，曝光獲得相應(yīng)條帶，采用ImageJ2x 軟件分析灰度值。

1.8 轉(zhuǎn)染novel_miR218的模擬物和拮抗物

按照Invitrogen公司提供Lipofectamine RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑說明書，分別將novel_miR218模擬物(novel_miR218 mimic)、novel_miR218 拮抗物(novel_miR218 inhibitor)及相應(yīng)的對(duì)照miRNA轉(zhuǎn)染入細(xì)胞中，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育48 h；之后分別于各孔接種1.0 MOI值PPRV，于37 ℃培養(yǎng)24 h；通過Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中SLAM和PPRV N蛋白的表達(dá)水平。每個(gè)試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)定對(duì)照組。

1.9 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)

2 結(jié) 果

2.1 PPRV在山羊PBMCs中的增殖規(guī)律

在PPRV感染山羊PBMCs后不同時(shí)間，通過觀察細(xì)胞CPE及檢測(cè)病毒N蛋白的表達(dá)量明確了PPRV N75-1毒株在山羊PBMCs中的復(fù)制規(guī)律。與對(duì)照組相比，PPRV感染細(xì)胞可見細(xì)胞腫脹、聚集及脫落等細(xì)胞病變，且隨著感染時(shí)間延長(zhǎng)細(xì)胞病變?cè)絹碓矫黠@(圖1)。Western blot結(jié)果顯示，PPRV N蛋白的表達(dá)水平在24 hpi時(shí)明顯增加且隨著感染時(shí)間延長(zhǎng)而不斷升高(圖2)。PPRV感染山羊PBMCs中SLAM蛋白的表達(dá)水平檢測(cè)表明，在24和48 hpi時(shí)SLAM表達(dá)水平較0 hpi時(shí)極顯著增加(P<0.01)，而在72和96 hpi時(shí)表達(dá)水平降低(圖2)。

圖1 PPRV感染山羊PBMCs后的細(xì)胞病變
Fig.1 CPE of PPRV-infected goat PBMCs

與對(duì)照組(0 hpi)比較，*.P<0.05; **.P<0.01
Compared with control (0 hpi), *.P<0.05; **.P<0.01
圖2 Western blot檢測(cè)PPRV感染山羊PBMCs中相關(guān)蛋白的表達(dá)
Fig.2 Western blot analysis of protein relative expression of PPRV-infected goat PBMCs

2.2 qRT-PCR檢測(cè)SLAM mRNA和novel_miR218表達(dá)水平

PPRV感染山羊PBMCs中SLAMmRNA和novel_miR218的qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明， 24 hpi時(shí)SLAMmRNA表達(dá)水平較0 hpi極顯著增加(P<0.01)，隨后逐漸降低；對(duì)照組SLAMmRNA表達(dá)水平在各檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)均較低(圖3)。Novel_miR218表達(dá)水平變化趨勢(shì)則與SLAMmRNA呈負(fù)相關(guān)，24 hpi時(shí)novel_miR218表達(dá)水平較0 hpi極顯著降低(P<0.01)，隨后逐漸升高；在24～96 hpi，PPRV感染組novel_miR218表達(dá)水平均顯著低于同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組(圖4)。

與對(duì)照組(0 hpi)比較，*.P<0.05; **.P<0.01
Compared with control (0 hpi), *.P<0.05; **.P<0.01
圖3 qRT-PCR檢測(cè)PPRV感染山羊PBMCs后SLAM mRNA水平
Fig.3 qRT-PCR analysis of SLAM mRNA expression fold of PPRV-infected goat PBMCs

與對(duì)照組(0 hpi)比較，*.P<0.05; **.P<0.01
Compared with control(0 hpi), *.P<0.05; **.P<0.01
圖4 qRT-PCR檢測(cè)PPRV感染山羊PBMCs后novel_miR218水平
Fig.4 qRT-PCR analysis of novel_miR218 expression fold of PPRV-infected goat PBMCs

2.3 轉(zhuǎn)染novel_miR218模擬物和拮抗物對(duì)SLAM和PPRV N蛋白的影響

如圖5所示，novel_miR218 mimic轉(zhuǎn)染組中SLAM和PPRV-N蛋白表達(dá)水平均較轉(zhuǎn)染對(duì)照組降低(P<0.05 或P<0.01)，且呈轉(zhuǎn)染濃度依賴性；相反地(圖6)，novel_miR218 inhibitor轉(zhuǎn)染組中SLAM和PPRV-N蛋白表達(dá)水平均較對(duì)照組呈轉(zhuǎn)染濃度依賴性升高(P<0.05或P<0.01)。表明novel_miR218對(duì)SLAM受體的蛋白表達(dá)具有明顯負(fù)調(diào)控作用，同時(shí)影響PPRV的增殖水平。

與對(duì)照組(MC)比較，*.P<0.05;**.P<0.01
Compared with control(MC), *.P<0.05; **.P<0.01
圖5 Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染novel_miR218 mimic后PPRV感染山羊PBMCs中相關(guān)蛋白表達(dá)水平
Fig.5 Western blot analysis of protein relative expression after the transfection of novel_miR218 mimic into PPRV-infected goat PBMCs

與對(duì)照組(IC)比較，*.P<0.05; **.P<0.01
Compared with control(IC), *.P<0.05; **.P<0.01
圖6 Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染novel_miR218 inhibitor后PPRV感染山羊PBMCs中相關(guān)蛋白表達(dá)水平
Fig.6 Western blot analysis of protein relative expression after the transfection of novel_miR218 inhibitor into PPRV-infected goat PBMCs

3 討 論

小反芻獸疫是由副黏病毒科麻疹病毒屬小反芻獸疫病毒(PPRV)引起的一種急性、熱性、高度接觸性一類傳染病，主要感染包括野生動(dòng)物在內(nèi)的小反芻動(dòng)物，其中山羊高度易感，綿羊易感。該病危害嚴(yán)重，其發(fā)病率可高達(dá)90%～100%，病死率可達(dá)50%～100%[11-13]。 與其他病毒一樣，PPRV侵染宿主細(xì)胞的“核心”機(jī)制是病毒與特定受體結(jié)合進(jìn)而感染宿主細(xì)胞[14-15]。然而，PPRV對(duì)感染宿主的致病機(jī)制尚不十分明了，特別是在山羊等高度易感動(dòng)物?，F(xiàn)已確定PPRV的天然受體有兩個(gè)：SLAM和脊髓灰質(zhì)炎病毒受體(Nectin4/PVRL4)。其中SLAM僅僅在T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞表面表達(dá)，Nectin4則主要在上皮細(xì)胞中表達(dá)[16-18]。SLAM是PPRV感染宿主并致病的關(guān)鍵受體，當(dāng)PPRV通過呼吸道途徑侵染宿主時(shí)，它首先與巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞表面SLAM受體發(fā)生結(jié)合并相互作用，而后被轉(zhuǎn)運(yùn)到局部淋巴結(jié)進(jìn)行增殖擴(kuò)散[19-23]。PPRV的N結(jié)構(gòu)蛋白被廣泛用于對(duì)PPRV增殖規(guī)律的研究[15,23-24]。2008年，Pawar等[4,24]在通過siRNA干擾技術(shù)證實(shí)SLAM是PPRV感染的病毒受體的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)山羊外周血單核細(xì)胞中SLAM的表達(dá)水平與PPRV復(fù)制具有很高的相關(guān)性，不同表達(dá)水平的SLAMmRNA影響病毒的復(fù)制和滴度。然而，目前對(duì)于SLAM表達(dá)水平的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。

越來越多的研究表明[25-26]，miRNAs與病毒的感染和致病有密切聯(lián)系，發(fā)揮著重要功能。在麻疹病毒屬的研究表明[27-28]，麻疹病毒感染可導(dǎo)致宿主細(xì)胞中miRNA表達(dá)譜及其相應(yīng)的靶基因mRNA表達(dá)發(fā)生顯著變化。此外，Geekiyanage和Galanis[29]研究表明，miR-31和miR-128可通過調(diào)控麻疹病毒在腫瘤細(xì)胞的受體Nectin4，進(jìn)而調(diào)控該病毒對(duì)該細(xì)胞的易感性。本實(shí)驗(yàn)室在對(duì)PPRV感染山羊PBMCs中miRNA表達(dá)譜進(jìn)行差異分析表明，novel_miR218有可能對(duì)SLAM受體的表達(dá)具有一定調(diào)節(jié)作用。本研究中通過檢測(cè)PPRV感染山羊PBMCs不同時(shí)間后SLAM和novel_miR218表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，novel_miR218表達(dá)水平變化趨勢(shì)與SLAMmRNA呈負(fù)相關(guān)，而轉(zhuǎn)染novel_miR218 mimic后SLAM和PPRV-N蛋白表達(dá)水平均較轉(zhuǎn)染對(duì)照組降低，轉(zhuǎn)染novel_miR218 inhibitor后SLAM和PPRV-N蛋白表達(dá)水平均較轉(zhuǎn)染對(duì)照組升高，以上結(jié)果表明novel_miR218對(duì)SLAM受體的蛋白表達(dá)具有明顯負(fù)調(diào)控作用。因此PPRV在早期侵染過程中，可能通過novel_miR218介導(dǎo)對(duì)SLAM受體表達(dá)豐度的調(diào)控，進(jìn)而影響PPRV在山羊PBMCs中的增殖水平。另外，本研究結(jié)果是否與PBMCs分離山羊種屬、性別等有關(guān)有待進(jìn)一步研究?，F(xiàn)已證實(shí)，除了麻疹病毒屬病毒外，其他多種病毒及致病菌也均以SLAM蛋白作為其在宿主細(xì)胞的感染受體并通過調(diào)控該受體表達(dá)水平進(jìn)而達(dá)到免疫逃逸[30]。因此，關(guān)于SLAM受體表達(dá)及其相關(guān)信號(hào)通路調(diào)控研究對(duì)深入了解相關(guān)病原體致病機(jī)制具有重要意義。

4 結(jié) 論

PPRV感染山羊PBMCs中SLAM受體表達(dá)水平與novel_miR218的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，其中SLAM受體表達(dá)呈先升高后降低趨勢(shì)，而novel_miR218的表達(dá)呈先降低后升高趨勢(shì)；山羊PBMCs源novel_miR218對(duì)SLAM受體表達(dá)具有負(fù)調(diào)控作用并對(duì)PPRV增殖水平有一定影響。本項(xiàng)目研究結(jié)果對(duì)進(jìn)一步闡明PPRV在羊源細(xì)胞中的復(fù)制及其致病機(jī)制等均具有重要的理論意義和潛在的應(yīng)用價(jià)值。