謝 軍，孫英杰，周昌孌，朱善元，丁 鏟*，柏家林

(1.西北民族大學(xué)生物工程與技術(shù)國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730030；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；3.西北民族大學(xué),甘肅省動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)研究中心，蘭州 730030；4.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院, 蘭州 730030；5. 江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，泰州 225300)

禽流感(avian influenza，AI)是由A型流感病毒(influenza virus A)引起的禽類傳染疾病。禽流感病毒屬正黏病毒科流感病毒屬，單股、負(fù)鏈、分節(jié)段的RNA病毒[1]。禽流感病毒不僅可以感染野生鳥類、水禽和家禽，還感染人類及貓、豬、馬、老虎等哺乳動(dòng)物[2-3]。AI可致家禽產(chǎn)生高達(dá)100%的發(fā)病率和死亡率，并可感染人和出生致死病例，對世界養(yǎng)禽業(yè)和人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅[4-5]。新城疫(Newcastle disease，ND)又稱亞洲雞瘟或偽雞瘟，是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的雞和火雞急性高度接觸性傳染病。新城疫病毒屬于副黏病毒科禽腮腺炎病毒屬，單股、負(fù)鏈、不分段的RNA病毒[6]。新城疫病毒主要是通過家禽個(gè)體間的直接傳播和通過呼吸道的飛沫或糞便等間接傳播方式傳播，其感染率和病死率可達(dá)100%[7]。禽流感和新城疫被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織列為必須報(bào)告的疾病，在我國被列為優(yōu)先防治的一類動(dòng)物疫病[8-9]。

家禽養(yǎng)殖過程中，多種病毒混合感染情況普遍存在。2000—2006年我國4個(gè)主要養(yǎng)雞大省5種免疫抑制性病毒的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示雞群中二重及多重混合感染的陽性率達(dá)31.73%，其中馬立克病毒(MDV)和雞傳染性貧血病毒(CIAV)、MDV和禽白血病病毒的二重感染陽性率最高[10]。中國、伊朗、巴基斯坦等國家自1997年均報(bào)道過H9N2弱毒AIV感染導(dǎo)致大量雞群死亡的事件，深入研究表明AIV與其他禽呼吸道疾病的共感染可能是導(dǎo)致雞群大規(guī)模死亡的原因[11-12]。Haghighat-Jahromi等[13]研究表明傳染性支氣管炎病毒(infectious bronchitis virus, IBV)與AIV共感染能夠顯著增強(qiáng)AIV病毒釋放，增強(qiáng)其致病性，導(dǎo)致雞群死亡。

AIV屬于正黏病毒科流感病毒屬，NDV屬于副黏病毒科禽腮腺炎病毒屬；副黏病毒與正黏病毒均是負(fù)鏈RNA病毒，其成熟病毒粒子均通過從細(xì)胞膜表面出芽釋放。AIV的核蛋白(nucleoprotein, NP)高度保守，在各亞型間的相似性達(dá)90%以上，是主要的型特異性抗原[12-13]。NDV的核蛋白對病毒基因組RNA及反基因組RNA的殼體包裹和病毒的復(fù)制至關(guān)重要。

全球范圍內(nèi)，野生水禽中多次檢測到NDV和AIV的共感染[14]。然而這兩種病毒共感染的機(jī)制、共感染病毒的復(fù)制和共感染的傳播途徑尚不明確。本試驗(yàn)研究了NDV和H9N2亞型AIV體外共感染雞成纖維細(xì)胞DF-1對病毒復(fù)制的影響，為研究AIV和NDV共感染機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，并為臨床上兩種病毒的防控提供了新的線索。

1 材料與方法

1.1 毒株和細(xì)胞

新城疫病毒Chicken/NL/Herts/33毒株由揚(yáng)州大學(xué)劉秀梵院士惠贈(zèng)，禽流感病毒A/HongKong/1073/99(H9N2) 毒株由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。雞成纖維細(xì)胞(DF-1)、犬腎細(xì)胞(MDCK)購自美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心(ATCC)，在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)。H9N2毒株和Herts/33毒株分別尿囊腔接種9日齡SPF雞胚，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，72 h后收集尿囊液，參照中華人民共和國獸用生物制品質(zhì)量規(guī)程[15]，用DF-1細(xì)胞和MDCK細(xì)胞計(jì)算Herts/33和H9N2的病毒滴度分別為106.5和104.7TCID50·mL-1。

1.2 試劑

DMEM培養(yǎng)基、細(xì)胞培養(yǎng)用磷酸鹽緩沖液(PBS)、胎牛血清FBS購自美國Hyclone公司。兔源禽流感NP抗體(A01506-40)購自金斯瑞生物科技有限公司，β-actin單克隆抗體(monoclcnal anti-β-actin， A1978)購自美國Sigma公司；鼠源NDV-NP抗體由本實(shí)驗(yàn)室制備。辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗鼠IgG和山羊抗兔IgG購自美國Jackson Immuno Research公司；預(yù)染蛋白質(zhì)Marker購自NEB公司；NC膜購自GE公司；SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液購自碧云天生物技術(shù)研究所；TRIzol購自Thermo Fisher公司；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶購自Promega公司；SYBR Premix ExTaqreagents購自TaKaRa公司；TBST為實(shí)驗(yàn)室自行配制。

1.3 病毒感染

單獨(dú)感染組：DF-1細(xì)胞復(fù)蘇后盲傳數(shù)代后接種至6孔培養(yǎng)板中，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細(xì)胞長至80%～90%密度時(shí)，棄去培養(yǎng)基， DMEM稀釋1.0 MOI的NDV病毒液接種細(xì)胞，吸附1 h后棄上清，換1% FBS的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)，間隔4 h、共計(jì)6個(gè)時(shí)間點(diǎn)收取樣品，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。AIV感染DF-1細(xì)胞步驟同NDV，但在病毒吸附和維持過程中在培養(yǎng)基中加入TPCK胰酶至終濃度1 μg·mL-1。

共感染組：復(fù)蘇培養(yǎng)的DF-1盲傳數(shù)代后接種至6孔板中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細(xì)胞長至80%～90%密度時(shí)，棄去培養(yǎng)基。根據(jù)單獨(dú)感染組1.0 MOI所需病毒含量，用不含F(xiàn)BS的DMEM稀釋的NDV和AIV接種細(xì)胞，吸附1 h后棄上清，換1% FBS維持液繼續(xù)培養(yǎng)，分別于12和24 h后收取樣品，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.4 Western blot

DF-1細(xì)胞復(fù)蘇盲傳數(shù)代后接種至6孔培養(yǎng)板中，感染病毒后指定時(shí)間收集細(xì)胞，使用SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液處理，樣品經(jīng)100 ℃水浴10 min，12 000 r·min-1離心后，-20 ℃保存。將處理后蛋白樣品進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳分離并轉(zhuǎn)印至0.2 μm NC膜，脫脂乳封閉2 h，TBST清洗后，NDV-NP抗體4 ℃孵育過夜，TBST清洗殘留抗體后室溫鼠源二抗孵育2 h，TBST清洗殘余抗體后顯色；使用一抗二抗去除液處理NC膜，進(jìn)行β-actin 抗體4 ℃孵育過夜，TBST清洗殘留抗體后室溫鼠源二抗孵育2 h，TBST清洗殘余抗體后顯色;AIV-NP抗體孵育步驟同NDV-NP抗體。

1.5 間接免疫熒光

DF-1細(xì)胞復(fù)蘇后盲傳數(shù)代接種至6孔板中(6孔 板中預(yù)先放入飛片)，感染病毒后12和24 h收取細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定，PBS清洗后4 ℃ 短期保存；將固定好的細(xì)胞用Triton X-100室溫透化10 min，TBST清洗三遍后使用3% BSA、37 ℃ 封閉處理30 min， 接種1∶250 PBS稀釋的兔源AIV-NP抗體，37 ℃孵育1.5 h，TBST振蕩清洗3次，每次5 min，避光條件下使用山羊抗兔的熒光二抗進(jìn)行染色，30 ℃孵育30 min，TBST處理后3% BSA封閉30 min；使用鼠源NDV-NP抗體孵育，二抗使用山羊抗鼠的熒光抗體，步驟同AIV-NP抗體孵育；DAPI細(xì)胞核染色，封片，激光共聚焦掃描顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.6 熒光定量PCR

DF-1細(xì)胞復(fù)蘇后盲傳3代接種至6孔板中，感染病毒后指定時(shí)間收集細(xì)胞，在細(xì)胞中加入1 mL TRIzol，按TRIzol Reagents操作手冊進(jìn)行病毒RNA提取，運(yùn)用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶依據(jù)通用引物：AGCAAAAGCAGG將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。分別使用編碼新城疫病毒NP蛋白和禽流感病毒NP蛋白基因序列設(shè)計(jì)特異引物，β-actin基因引物作為內(nèi)參(表1)。利用SYBR Premix ExTaqreagents進(jìn)行相對定量熒光實(shí)時(shí)定量PCR，熒光定量PCR反應(yīng)緩沖體系為20 μL： SYBR Premix ExTaq(2×) 10 μL，上游引物和下游引物各10 pmol，ROX Reference Dye(50×)0.4 μL，cDNA為模板20 ng，補(bǔ)ddH2O(滅菌蒸餾水)至20 μL。熒光定量PCR反應(yīng)程序如下：95 ℃預(yù)變性30 s；(95 ℃ 5 s, 55 ℃ 30 s)×40個(gè)循環(huán)，最后加上熔解曲線反應(yīng)以驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物特異性。mRNA的相對表達(dá)量以-ΔΔCT方法計(jì)算[16]。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

Western blot結(jié)果數(shù)據(jù)使用Image-Pro Plus進(jìn)行蛋白灰度值分析：目的蛋白的灰度=目的蛋白IOD值/相對內(nèi)參IOD值；間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Image-Pro Plus進(jìn)行光密度值檢測病毒蛋白表達(dá)豐度分析；數(shù)據(jù)結(jié)果通過GraphPad Prism6進(jìn)行作圖，Student’s test統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(***代表P<0.001; **代表P<0.01,*代表P<0.05)。

表1AIVNP和NDVNP基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR引物序列

Table1TheprimersequencesofAIVNPandNDVNPforreal-timefluorescentquantitativePCR

引物Primer序列(5′→3′)SequenceNDV NP rtLAGCTGGGGTTGAAGATGATGNDV NP rtRACCGTGACCCATACTTGAGCAIV NP rtLGTCGCCAGTGGGTATGATTTAIV NP rtRCTAATGAGGCTGAAGACCTGACβ-actin rtLCAGACATCAGGGTGTGATGGβ-actin rtRTCAGGGGCTACTCTCAGCTC

2 結(jié) 果

2.1 NDV/AIV單獨(dú)感染后病毒蛋白表達(dá)

NDV Herts/33感染DF-1細(xì)胞后12 h出現(xiàn)細(xì)胞病變，24 h細(xì)胞開始脫落；AIV感染DF-1細(xì)胞后也是12 h出現(xiàn)細(xì)胞病變，24 h細(xì)胞開始脫落。由于AIV和NDV的NP蛋白在各型之間保守且與病毒基因組復(fù)制密切相關(guān)，因此本試驗(yàn)運(yùn)用Western blot通過檢測NDV和AIV NP蛋白的表達(dá)量變化來研究病毒復(fù)制情況，并通過Image-Pro Plus進(jìn)行蛋白灰度值分析(目的蛋白的灰度=目的蛋白IOD值/相對內(nèi)參IOD值)。Western blot檢測顯示NDV和AIV均在感染后8 h左右進(jìn)入對數(shù)復(fù)制期，NDV感染后16～24 h進(jìn)入平臺期，AIV感染后8～24 h處于對數(shù)復(fù)制期(圖1)。該結(jié)果與病毒誘導(dǎo)細(xì)胞病變時(shí)間一致，12 h左右出現(xiàn)細(xì)胞病變，24 h左右細(xì)胞開始脫落，因此，筆者選取病毒感染后12和24 h作為共感染的樣品采集點(diǎn)。

A. NDV感染后不同時(shí)間點(diǎn)NP蛋白表達(dá)；B. NDV NP蛋白灰度掃描結(jié)果；C. AIV感染后不同時(shí)間點(diǎn)NP蛋白表達(dá)；D. AIV NP蛋白灰度掃描結(jié)果
A. The NP expression at different time points post NDV infection; B. The intensity band ratio of NDV NP to β-actin; C. The NP expression at different time points post AIV infection; D. The intensity band ratio of AIV NP to β-actin
圖1 NDV/AIV單獨(dú)感染不同時(shí)間點(diǎn)病毒蛋白Western blot檢測
Fig.1 Western blot analysis of virus protein at different time points post NDV/AIV infection individually

2.2 NDV-AIV共感染導(dǎo)致病毒蛋白水平降低

為了觀察NDV和AIV的共感染對兩種病毒復(fù)制的影響，通過Western blot對NDV和AIV的NP蛋白分別檢測并對檢測的病毒蛋白Western blot圖進(jìn)行Image-Pro Plus蛋白灰度值分析。結(jié)果顯示兩種病毒共感染時(shí)AIV-NP和NDV-NP蛋白表達(dá)明顯受到了抑制(圖2A、2C)。與單獨(dú)感染NDV相比，Western blot灰度值共感染12和24 h NDV NP蛋白的表達(dá)分別下調(diào)了70.6% (P<0.001) 和45.7% (P<0.001)(圖2B)；而共感染12和24 h AIV NP蛋白的表達(dá)分別下調(diào)了61.5%(P<0.001) 和82.8%(P<0.001)(圖2D)。表明NDV和AIV的共感染能夠極顯著降低NDV和AIV病毒蛋白的表達(dá)。

A. NDV-AIV共感染對NDV NP蛋白表達(dá)的影響；B. NDV NP蛋白灰度掃描結(jié)果；C. NDV-AIV共感染對AIV NP蛋白表達(dá)的影響；D. AIV NP蛋白灰度掃描結(jié)果
A. The impact of NDV-AIV co-infection in NDV NP expression; B. The intensity band ratio of NDV NP to β-actin; C. The impact of NDV-AIV co-infection in AIV NP expression; D. The intensity band ratio of AIV NP to β-actin
圖2 NDV-AIV共感染對病毒蛋白表達(dá)的影響
Fig.2 The impact of NDV-AIV co-infection in virus protein expression

2.3 NDV-AIV共感染導(dǎo)致細(xì)胞中病毒蛋白豐度降低

為了更直觀地觀察共感染對細(xì)胞中病毒復(fù)制水平的影響，通過對單獨(dú)感染組和共感染試驗(yàn)組中病毒蛋白進(jìn)行熒光標(biāo)記，激光共聚顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)的病毒蛋白分布，結(jié)果顯示NDV/AIV單獨(dú)感染12 h 后，90%以上的細(xì)胞均顯示病毒蛋白熒光，而共感染組中僅能觀察到零星的紅色或綠色熒光點(diǎn)；病毒感染后24 h，單獨(dú)感染組中幾乎所有細(xì)胞均有病毒蛋白熒光，而共感染組中病毒蛋白熒光點(diǎn)有一定程度降低(圖3A)。為更直觀進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，對間接免疫熒光圖進(jìn)行Image-Pro Plus光密度值分析：與單獨(dú)感染組相比，共感染組NDV和AIV的NP蛋白熒光密度值在感染12 h時(shí)間點(diǎn)分別下調(diào)81.1% (P<0.001) 和65.5%(P<0.001)(圖3B、C)，而24 h時(shí)則分別下調(diào)41.2%(P<0.05)和47.4%(P<0.001) (圖3B、C)。以上結(jié)果說明NDV-AIV共感染顯著降低了細(xì)胞中病毒蛋白豐度，與病毒感染晚期(24 h)相比，病毒感染后12 h細(xì)胞中病毒蛋白豐度降低的更明顯。

2.4 NDV-AIV共感染導(dǎo)致細(xì)胞中病毒mRNA水平降低

為了觀察NDV-AIV共感染是否在基因水平也能抑制病毒的復(fù)制，收取病毒感染后的細(xì)胞樣品，對NDV和AIV的NPmRNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測。與單獨(dú)感染NDV組相比，共感染12和24 h組NDVNP的mRNA水平分別下調(diào)了64.3% (P<0.001)和64.4% (P<0.05)(圖4A)；而與單獨(dú)感染AIV組相比，共感染12和24 h組AIV NP蛋白的表達(dá)分別下調(diào)了61.5%(P<0.001)和63.0%(P<0.001) (圖4B)。表明NDV-AIV共感染組中NDV和AIV的病毒基因mRNA水平均受到顯著抑制。

3 討 論

NDV和AIV屬于家禽養(yǎng)殖中最常見的兩種病毒，因此NDV和AIV臨床上發(fā)生共感染比較普遍。2008年美國明尼蘇達(dá)和北達(dá)科他州7 260份水禽泄殖腔拭子的PCR檢測結(jié)果顯示大部分樣品中都同時(shí)混有AIV和NDV，但將其接種雞胚，結(jié)果僅NDV被分離出來[17]，提示共感染過程中NDV對AIV的復(fù)制可能有抑制作用。2012年Ge等[18]的雞胚接種試驗(yàn)表明AIV能夠抑制NDV復(fù)制，但NDV不能抑制AIV復(fù)制，除非NDV首先接種，一定時(shí)間后再接種AIV，NDV才能夠抑制AIV復(fù)制。體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果顯示，弱毒NDV能夠延緩弱毒AIV病毒粒子的釋放，反之亦然[19]。這些試驗(yàn)提示NDV與AIV之間存在互相干預(yù)，但都是基于流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)或基因水平的檢測[17-20]，尚未有蛋白或病毒水平的研究報(bào)道。

A. NDV-AIV共感染對NDV和AIV病毒蛋白豐度的影響；B. NDV NP光密度值計(jì)算結(jié)果；C. AIV NP光密度值計(jì)算結(jié)果
A. The impact of NDV-AIV co-infection in viral protein abundance in the cells; B. The optical intensity band ratio of NDV NP to DAPI; C. The optical intensity band ratio of AIV NP to DAPI
圖3 NDV-AIV共感染對細(xì)胞中病毒蛋白豐度的影響
Fig.3 The impact of NDV-AIV co-infection in viral protein abundance in the cell

A.NDV-AIV共感染對NDV NP mRNA水平的影響；B.NDV-AIV共感染對AIV NP mRNA水平的影響
A.The impact of NDV-AIV co-infection in NDV NP mRNA level; B. The impact of NDV-AIV co-infection in AIV NP mRNA level
圖4 NDV-AIV共感染對病毒mRNA水平的影響
Fig.4 The impact of NDV-AIV co-infection in viral mRNA level

NDV和AIV均有血凝素和神經(jīng)氨酸酶蛋白，不能通過血凝試驗(yàn)從混合感染樣本中分別檢測NDV和AIV；同時(shí)，這兩種病毒也有相似的細(xì)胞和雞胚嗜性，難以通過細(xì)胞或雞胚接種分別檢測病毒的復(fù)制水平。本研究通過NDV和AIV NP蛋白特異性抗體以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物可以區(qū)分NDV和AIV感染，具有很好的特異性。與單獨(dú)感染組相比，共感染組NDV和AIV的NP蛋白熒光密度值在感染12 h時(shí)間點(diǎn)分別下調(diào)81.1%和65.5%，而24 h時(shí)則分別下調(diào)41.2%和47.4%；而共感染細(xì)胞中病毒NDVNP基因mRNA表達(dá)水平12和24 h分別下調(diào)了64.3%和64.4%，AIVNP基因mRNA表達(dá)分別下調(diào)了61.5%和63.0%。表明NDV-AIV共感染能夠顯著降低NDV和AIV NP蛋白與mRNA水平，在病毒感染對數(shù)生長期更明顯。這與以往的體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果一致，由于細(xì)胞水平的試驗(yàn)排除了諸如個(gè)體差異、組織親嗜性等一些復(fù)雜因素的影響，因此，本研究為NDV與AIV之間相互抑制提供了更有力的證據(jù)。

AIV與NDV在體外與體內(nèi)相互之間的干擾現(xiàn)象雖已被證實(shí)，但其機(jī)制尚未闡明。值得注意的是，本研究的間接免疫熒光中DF-1細(xì)胞中同時(shí)有NDV NP和AIV NP的熒光染色，證明兩種病毒能夠在同一個(gè)細(xì)胞中復(fù)制，這說明兩種病毒能同時(shí)感染同一個(gè)細(xì)胞，這并不能作為兩者之間相互干擾的解釋。本研究基于雞成纖維細(xì)胞模型，因此可以排除一些由特殊的免疫器官和免疫細(xì)胞介導(dǎo)的獲得性免疫機(jī)制，先天性的抗病毒機(jī)制可能在其中發(fā)揮重要作用。一種最有可能的解釋是，NDV或AIV感染產(chǎn)生的干擾素(IFN)和下游抗病毒分子能夠抑制另一種病毒的復(fù)制，IFN-α/β能與Ⅰ型干擾素受體結(jié)合，通過活化JAK-STAT信號通路誘導(dǎo)達(dá)300多種干擾素刺激的基因的表達(dá)，其中包括抗病毒蛋白。目前已經(jīng)得到證實(shí)的可以抑制病毒增殖的干擾素刺激基因有PKR、MXGTPase和RNaseL等[21]。這些抗病毒分子可能在共感染過程中發(fā)揮協(xié)同抑制的作用。除了IFN之外，另一種可能是NDV和AIV的共感染過程中協(xié)同引起細(xì)胞凋亡信號通路的激活[22]，從而抑制了兩種病毒的復(fù)制。此外，細(xì)胞自噬[23]等其他先天性的抗病毒信號通路也可能參與其中。本研究證實(shí)了細(xì)胞水平上AIV與NDV的復(fù)制存在相互抑制現(xiàn)象，這為研究NDV和AIV的共感染機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，從另一角度為臨床上兩種病毒的防控提供了新的線索。

4 結(jié) 論

運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western blot和間接免疫熒光檢測了H9N2亞型AIV和NDV單獨(dú)感染與共感染DF-1細(xì)胞對兩種病毒NP蛋白表達(dá)的相互影響。與單獨(dú)感染組相比，NDV和AIV的共感染極顯著降低了感染細(xì)胞中兩種病毒核蛋白的表達(dá)水平和細(xì)胞中核蛋白的豐度；共感染組細(xì)胞中的病毒核蛋白基因mRNA表達(dá)水平也極顯著降低。表明AIV與NDV的共感染在細(xì)胞水平上可引起病毒復(fù)制的相互抑制，為研究NDV和AIV的共感染機(jī)制在細(xì)胞水平上奠定了基礎(chǔ)。