唐 朋，凌笑笑，賈聰俊，梁春年，吳曉云，王宏博，褚 敏，閻 萍*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅省牦牛繁育重點實驗室，蘭州 730050；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，蘭州 730050)

牦牛是青藏高原地區(qū)重要的經(jīng)濟動物，其提供的肉、奶和毛皮是當?shù)啬撩褓囈陨婧桶l(fā)展的生活資料，同時也是牧區(qū)經(jīng)濟的支柱產(chǎn)業(yè)和牧民經(jīng)濟收入的主要來源[1]。但與其它哺乳動物相比，牦牛兩年一胎或三年兩胎的低繁殖率，成為制約高原畜牧業(yè)發(fā)展及生態(tài)保護的主要瓶頸。人工授精(artificial insemination，AI)是提高牦牛繁殖效率不可或缺的環(huán)節(jié)，這就需要解決精液冷凍保存問題。精液冷凍保存技術是現(xiàn)代常用的輔助生殖技術，可長期有效保存優(yōu)質(zhì)種公畜遺傳資源，加快育種進程。然而，凍融后精子活力和繁殖力的明顯降低是導致人工授精失敗的根本原因[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，在精液冷凍和解凍過程中，精子發(fā)生不可逆的質(zhì)膜破裂、酶(蛋白質(zhì))的變性、脂質(zhì)過氧化作用導致的氧化應激、DNA損傷等致命性損傷，導致至少50%的精子活力降低，甚至死亡，推測這可能與凍融過程中精子蛋白功能的損傷有關[3-6]。Huang等[7]研究發(fā)現(xiàn)，凍融后精子活力的維持需要一些蛋白質(zhì)發(fā)揮作用。因此，分析精子中蛋白質(zhì)的變化可能是預測精子質(zhì)量的有效方法。

熱休克蛋白(heat shock protein，HSPs)，又稱為熱應激蛋白或應激蛋白，是細胞及生物體在理化和生物等應激原刺激后，所產(chǎn)生的一類伴隨細胞內(nèi)功能性伴侶蛋白。作為分子伴侶，HSPs可通過調(diào)控高度特化的信號轉導和轉錄因子在內(nèi)的蛋白質(zhì)折疊，維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。HSPs還具有抗凋亡特性，可以調(diào)節(jié)各種免疫反應。因此，HSPs作為潛在的臨床診斷標志物是醫(yī)學領域中的研究熱點[8]。HSP70是HSPs家族最廣泛、最重要的成員，在細胞內(nèi)源性保護機制中發(fā)揮重要作用[9]。HSP70在蛋白質(zhì)折疊和重折疊，識別非天然蛋白質(zhì)構象，蛋白質(zhì)的跨膜轉運防止新合成的蛋白質(zhì)聚集，處理受損和錯誤折疊蛋白質(zhì)等方面發(fā)揮重要作用[10-11]。李俊杰等[12]研究發(fā)現(xiàn)，精子由于應激產(chǎn)生HSP70，增強細胞對外界損傷的耐受程度，維持細胞的正常代謝功能，且與哺乳動物精子的生成相關。敲除HSP70小鼠表現(xiàn)為精母細胞結構異常，初級精母細胞形成受阻，細胞凋亡數(shù)增加等[13]。還有報道認為，HSP70可能在人精-卵識別中發(fā)揮重要作用，其蛋白表達水平與牛、豬的受精率密切相關[14-16]。雖然有研究表明，凍融精液與鮮精相比，精子受精能力明顯降低[17]，但凍融后牦牛精子質(zhì)量、精子HSP70表達量變化鮮少報道。因此，本試驗以大通牦牛為研究對象，探究冷凍前后對精子活力、質(zhì)膜完整性的影響；采用qRT-PCR、Western blot和免疫熒光技術探究冷凍前后精子HSP70表達量及蛋白分布的變化，為探索HSP70在牦牛精子中的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 本試驗所用的牦牛精液均來自青海省大通種牛場繁育研究中心。假陰道法(40 ℃) 采集6頭健康且繁殖能力正常的大通牦牛種公牛的精液。鮮精活力≥ 0.70，凍精活力≥ 0.30，精子密度≥ 1×108·mL-1。

1.1.2 主要試劑 Percoll細胞分離液、12孔板專用細胞爬片均購自索萊寶科技有限公司(北京)，反轉錄試劑盒、實時熒光定量試劑盒均購自寶生物公司(大連)，Anti-HSP70(ab2787)抗體、二抗均購自Abcam公司(美國)，RNeasy mini kit購自QIAGEN生物公司(德國)，BIOXcell稀釋液購自IMV(德國卡蘇)生物公司，Western blot和免疫熒光檢測所用的其他試劑均購自碧云天生物公司(南京)。

1.2 鮮精稀釋、凍精解凍及精子純化

1.2.1 稀釋液配置 低溫稀釋液與冷凍稀釋液配置相同，均由1體積BIOXcell稀釋液和4倍體積滅菌雙蒸水組成。

1.2.2 牦牛鮮精采集及稀釋 新鮮精液用光學顯微鏡進行精液常規(guī)品質(zhì)檢查，將精子活力在70%以上、無異味、色澤正常的精液中緩慢加入2倍體積低溫稀釋液(37 ℃預熱)，輕輕搖晃，使精液與稀釋液充分接觸，室溫下靜置平衡2 h，放入4 ℃恒溫箱中運回實驗室備用。

1.2.3 牦牛精液冷凍與解凍 取對應牦牛的精液置于試管中，室溫下800 r·min-1低速離心10 min， 棄上清，沉淀用冷凍稀釋液1∶2稀釋，并分裝于0.25 mL的冷凍細管中，封口機封口。放入冷凍程序儀中，以3 ℃·min-1速率降至4 ℃，平衡2～3 h， 用液氮熏蒸法處理10 min后，投入液氮中保存。

解凍時，將冷凍細管從液氮中迅速取出后，立即放到37 ℃水浴鍋中，解凍15 s，待精液完全溶解后，取出細管，剪開兩端，倒出精液進行后續(xù)試驗。

1.2.4 精子純化 取適量新鮮精液和凍融精液分別緩慢加入3倍體積45% Percoll單層梯度液上層，800 r·min-1離心20 min，去上清，向沉淀中加3 mL PBS緩沖液洗滌2次，5 000 r·min-1離心5 min， 留沉淀。

1.3 冷凍前后精子質(zhì)量評定

精子活力：分別取10 μL新鮮精液和凍融精液均勻滴于37 ℃預熱的載玻片上，蓋上蓋玻片，放在恒溫電子加熱板上1 min左右。在光學顯微鏡下，取5個不同視野觀察精子運動狀態(tài)，對直線運動的精子進行計數(shù)，計算精子活力。每種處理6個生物學重復。

精子質(zhì)膜完整性：采用低滲腫脹-伊紅拒染法(hypoosmotic swelling- excludingeosin Y test，HOS-EY)。將低滲液先置于37 ℃密閉離心管中，加熱5 min， 適量精液與低滲液混合，37 ℃孵育30 min，加入0.05 mL伊紅低滲染料，混勻。在100×相差顯微鏡下觀察300個精子形態(tài)和染色情況，質(zhì)膜完整表現(xiàn)為尾部彎曲和頭部未著色，同時計算質(zhì)膜完整率。每種處理6個生物學重復。

1.4 冷凍前后牦牛精子HSP70基因表達檢測

1.4.1 總RNA提取及cDNA合成 取適量純化后精子，參照RNeasy mini kit操作說明進行總RNA提取。用NanoDrop 2000超微量分光光度計檢測總RNA濃度和純度，選擇OD260nm/OD280nm為1.8～2.1的總RNA樣品，參照反轉錄試劑盒說明，將500 ng總RNA反轉錄為等濃度cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 qRT-PCR 利用Primer Premier 5.0軟件，根據(jù)GenBank公布的牛HSP70(登錄號：NM_203322)和β-actin(登錄號：NM_173979)基因序列設計特異性引物(表1)，引物由北京擎科生物技術股份有限公司合成。按照熒光定量試劑盒建議的體系進行qRT-PCR擴增。反應體系為25 μL：SYBR GreenⅠPremix Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 3 μL，加RNase-free ddH2O至總體積25 μL。反應程序采用兩步法：94 ℃預變性30 s；94 ℃變性5 s， 60 ℃退火30 s，40個循環(huán)。每個樣品重復3次。

表1引物序列

Table1Theprimersequences

基因Gene引物序列(5′→3′)The sequences of primer產(chǎn)物長度/bp Product lengthHSP70F: TGTCGCTGGGACTGGAGA,R: GCTGGTTGTCCGAGTAGGTG111β-actinF: ATTGCCGATGGTGATGAC,R: ACGGAGCGTGGCTACAG177

1.5 Western blot檢測冷凍前后牦牛精子HSP70蛋白

適量鮮精和凍精純化后，加入裂解液和PMSF，置于冰上裂解30 min，超聲波破碎，12 000 r·min-1，4 ℃離心10 min，保留上清蛋白溶液。BCA蛋白濃度測定試劑盒定量總蛋白質(zhì)濃度，分裝,置于-20 ℃ 冰箱保存。采用常規(guī)Western blot方法測定提取蛋白樣品中HSP70含量水平。取適量蛋白按比例加入5× SDS上樣緩沖液，100 ℃煮沸10 min，每孔上樣量為20 μg，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳、轉至PVDF膜及封閉后(5% BSA，37 ℃2.5 h)，分別加入HSP70和α-tubulin一抗，4 ℃孵育過夜。PBS搖床洗膜3次，加入HRP標記二抗，37 ℃孵育1.5 h， PBS洗膜3次，電化學發(fā)光(electrochemiluminescence，ECL)試劑盒進行曝光拍照，記錄試驗結果。使用Image J圖像分析軟件掃描測定，重復3次， 計算每個條帶的總灰度值。HSP70蛋白相對含量=HSP70蛋白灰度值/α-tubulin蛋白灰度值。

1.6 免疫熒光檢測冷凍前后牦牛精子HSP70蛋白

適量牦牛精液純化后，加4%多聚甲醛混勻，固定25 min， 取3 μL均勻鋪至TC處理的蓋玻片上，風干后PBS清洗3次，每次10 min；用1% Triton X-100 通透15 min，PBS清洗3次；5% BSA封閉30 min，PBS清洗3次；HSP70一抗(1∶100)37 ℃濕盒中孵育2 h，PBS清洗3次；加入FITC標記二抗(1∶100)，暗盒中37 ℃靜置1 h，PBS清洗3次；DAPI染核5 min，PBS洗3次；將蓋玻片轉移至載玻片上，甘油封片；熒光顯微鏡下觀察并拍照，每張片子隨機選取5個視野，使用Image J圖像分析軟件分析每個視野內(nèi)陽性區(qū)域HSP70的光密度值。

1.7 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)均以“平均值±標準誤(mean±SE)”表示，qRT-PCR以β-actin作為內(nèi)參基因，冷凍前后HSP70基因相對表達量采用2-△△Ct方法進行均一化處理。采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行t檢驗分析，每個處理6個重復，差異顯著性水平為P<0.05。GraphPad Prism 5.0軟件作圖。

2 結 果

2.1 冷凍前后精子活力和質(zhì)膜完整性的變化

分別采集6頭牦牛新鮮和凍融精液，分析冷凍前后牦牛精子活力、質(zhì)膜完整率的變化，結果見圖1和表2。由表2可見，鮮精組精子活力、質(zhì)膜完整率分別為(71.7±1.054)%、(78.4±0.698)%，凍精組精子活力和質(zhì)膜完整率分別為(33.3±0.494)%、(38.2±1.124)%，與鮮精組相比，凍精組精子活力和質(zhì)膜完整率均極顯著降低(P<0.01)。

A.鮮精組；B.凍精組。1.質(zhì)膜完整的精子；2.質(zhì)膜不完整的精子
A. Fresh group；B. Frozen-thawed group. 1.Sperm with integral plasma membrane；2.Sperm with incomplete plasma membrane
圖1 冷凍前后精子質(zhì)膜完整性檢測(100×)
Fig.1 Detection of sperm plasma membrane integrity before and after freezing(100×)

表2冷凍前后精子活力和質(zhì)膜完整性測定(n=6)

Table2Detectionofspermmotilityandplasmamembraneintegritybeforeandafterfreezing(n=6)

組別Group精子活力/%Sperm motility質(zhì)膜完整率/%Plasma membrane integrity rate鮮精組Fresh group71.7±1.054A78.4±0.698A凍精組Frozen-thawed group33.3±0.494B38.2±1.124B

同列上標不同大寫字母表示組間差異極顯著(P<0.01)

Means in the same column with different capital letter superscripts differ extremely significantly between groups(P<0.01)

2.2 冷凍前后精子中HSP70 mRNA的表達

qRT-PCR結果顯示(圖2)，HSP70在精子冷凍前后均有表達，但表達量存在差異。與鮮精相比，凍精HSP70相對表達量顯著降低(P<0.05)。

D. 凍精組；X. 鮮精組。組間比較，*. P<0.05。下同
D. Freezing group; X. Fresh group. Comparison between groups, *.P<0.05. The same as follows
圖2 冷凍前后牦牛精子HSP70 mRNA的表達量
Fig.2 Expression of HSP70 mRNA in yak sperm before and after freezing

2.3 冷凍前后精子中HSP70蛋白的表達

通過Western blot分析冷凍前后牦牛精子中HSP70蛋白相對表達量(圖3)結果可知，冷凍前后精子中HSP70蛋白水平表達趨勢與轉錄水平較為類似。HSP70蛋白在精子冷凍前后均有表達，但表達量存在差異。鮮精中HSP70蛋白表達量極顯著高于凍精(P<0.01)。

A. Western blot檢測;B. HSP70蛋白相對表達量。**. P<0.01。下同
A. Western blot detection; B. The relative expression of HSP70 protein.**. P<0.01. The same as follow
圖3 冷凍前后牦牛精子HSP70蛋白相對表達
Fig.3 Relative expression of HSP70 protein in yak sperm before and after freezing

2.4 冷凍前后精子中HSP70蛋白的表達與定位

免疫熒光檢測結果如圖4所示，冷凍前后精子細胞內(nèi)HSP70蛋白均有不同程度的表達。在鮮精中，免疫陽性反應主要定位于精子頂體區(qū)、頂體赤道段、后頂體區(qū)和精子中段，而凍精HSP70蛋白主要在精子后頂體區(qū)和精子中段表達。鮮精組HSP70蛋白的平均光密度值極顯著高于凍精(P<0.01)。

A.HSP70蛋白免疫熒光檢測(100×)；B.平均光密度值分析
A. Immunofluorescence detection of HSP70 protein(100×)；B. Average optical density analysis
圖4 冷凍前后牦牛精子HSP70蛋白的表達
Fig.4 Expression of HSP70 protein in yak sperm before and after freezing

3 討 論

3.1 冷凍前后HSP70表達變化

HSP70蛋白主要存在于細胞質(zhì)和細胞核內(nèi)，作為分子伴侶，主要參與蛋白質(zhì)折疊，維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。研究表明，溫度的變化可能會影響精子質(zhì)量，凍融過程導致40%～50%活精子損失[3,18]。研究發(fā)現(xiàn)，正常精子HSP70表達水平高于異?；蛩谰覽19]。本研究采用qRT-PCR和Western blot方法確定冷凍前后HSP70表達量差異，研究結果顯示，凍融后精子HSP70 mRNA表達量顯著降低(P<0.05)；HSP70蛋白水平極顯著下降(P<0.01)，這種由溫度變化導致的牦牛精子HSP70表達量下降與先前研究結果一致[17]，可能由于凍融后死精子數(shù)的增加導致HSP70合成減少；也可能是精子中HSP70被用于合成其它酶類以降低精子在超低溫條件下的損傷。

成熟精子HSP70蛋白亞細胞定位與其他體細胞不同，精子處于獲能或頂體反應的不同階段，HSP70呈現(xiàn)出一個動態(tài)再分配過程。在誘導獲能期間，HSP70蛋白緩慢沿著精子質(zhì)膜側向遷移和重排。正常生理狀態(tài)下，處于不同階段的精子細胞中HSP70蛋白分配至不同部位，但其表達量不會存在顯著差異[15]。Kamaruddin等[20]研究發(fā)現(xiàn)，剛射出的精子僅在頂體檢測到HSP70，而經(jīng)獲能和頂體反應的精子HSP70被重新分配至赤道段、后頂體區(qū)和精子中段。本研究進一步采用免疫熒光對HSP70蛋白表達定位顯示：鮮精HSP70定位于頂體區(qū)、頂體赤道段、后頂體區(qū)和精子中段；凍精HSP70蛋白主要定位于后頂體區(qū)和精子中段。與鮮精相比，凍精HSP70平均光密度值極顯著減弱(P<0.01)。本試驗結果與Varghese等[21]的研究結論相似。推測冷凍前后HSP70蛋白的定位差異可能是導致冷凍精子繁殖力降低的原因。

3.2 冷凍前后精液品質(zhì)評估

目前，用來評估凍融后精子質(zhì)量的參數(shù)有精子活力和質(zhì)膜完整性。研究發(fā)現(xiàn)，HSP70與脂質(zhì)膜相互作用，推測其參與膜蛋白和跨膜易位蛋白的折疊[22]。本研究通過分析比較鮮精組和凍融組精子質(zhì)膜完整性發(fā)現(xiàn)，凍融后精子質(zhì)膜完整性極顯著下降(P<0.01)，這可能與精子HSP70蛋白降低有關。線粒體是精子能量的主要來源，凍融后精子活力的下降與線粒體結構損傷及ATP水平降低有關[23]。而HSPs具有一種內(nèi)在的ATP酶活性，對于體內(nèi)靶蛋白活化是必不可少的[24]。Aboagla等[25]發(fā)現(xiàn)精子膜蛋白在膜的流動性中發(fā)揮重要作用，精子膜蛋白異常折疊導致膜的流動性降低，進而影響精子活力。本研究結果表明，凍融后精子活力極顯著降低(P<0.01)，這與王昕等[26]的研究結果一致，推測可能與精子HSP70表達量有關，仍需進一步研究。

4 結 論

HSP70 mRNA與蛋白在冷凍前后牦牛精子內(nèi)均有表達，但表達量和分布存在差異。其中凍融后HSP70在轉錄和翻譯水平分別呈現(xiàn)顯著(P<0.05)和極顯著降低(P<0.01)。免疫熒光結果顯示，鮮精HSP70主要在頂體區(qū)、頂體赤道段、后頂體區(qū)和精子中段表達，而凍精HSP70主要定位于后頂體區(qū)和精子中段且平均光密度值極顯著降低(P<0.01)。本研究為探索HSP70在牦牛精子中的生物學功能提供了基礎數(shù)據(jù)，但其作用機制有待深入研究。