張廷煥，柴 捷，陳 磊，龍 熙*

(1. 重慶市畜牧科學院，重慶 402460； 2.農(nóng)業(yè)部養(yǎng)豬科學重點實驗室，重慶 402460)

家畜在長期的馴化過程中受到了不同選擇,毛色呈現(xiàn)出不同的變化[1]。毛色在動物生理調節(jié)和環(huán)境適應過程中起著重要作用，比如不同毛色會導致熱交換出現(xiàn)差異，從而影響動物體溫的調控[2]。除此之外，在家畜育種中，毛色更是作為一種經(jīng)濟性狀受到強烈的人工選擇。家豬毛色變異復雜，如果能明確毛色變異分子機制，可以通過遺傳育種手段定向改變家豬毛色，形成特定品種特征，提高群體的表型一致性。

毛色是由表皮、毛囊內黑色素細胞的分布和活性決定的[3-4]。小眼畸形相關轉錄因子-M型(microphthalmia associated transcription factor M,MITF-M)選擇性表達于黑色素細胞中，控制著黑色素細胞的發(fā)育、功能和凋亡，在黑色素生成通路中居于核心位置[5-6]。MITF-M還調控著3大主要色素合成酶包括酪氨酸酶(TYR)、酪氨酸相關蛋白1(TYRP1)和酪氨酸相關蛋白2(TYRP2)[7]的轉錄。目前在多個物種(比如，雞、牛、羊)上已證明,MITF-M對動物毛色變化起著至關重要的作用[8-10]，而豬毛色全基因組關聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，MITF基因位點在不同程度毛色白化的豬種中受到強烈選擇，比如，巴馬香豬、寧鄉(xiāng)豬、五指山豬等。同時，在榮昌豬中的研究證實，MITF-M轉錄調控區(qū)一個位點的插入突變引起了SOX蛋白的結合，影響了MITF-M的轉錄活性降低其表達水平，最終導致豬毛色白化現(xiàn)象[11]。然而，豬MITF-M轉錄調控區(qū)域的結構和功能尚不清楚，關于豬MITF-M主要轉錄調控區(qū)域及其轉錄因子的研究尚未見報道。

本試驗以豬DNA為模板，通過PCR擴增得到MITF-M的轉錄調控區(qū)域；采用生物信息學對調控區(qū)的序列特征進行分析；根據(jù)序列結構特征分布情況構建5′端缺失報告基因重組載體；利用雙熒光素酶報告基因試驗對重組載體進行轉錄活性分析，尋找活性差異的調控區(qū)域；再利用干擾RNA技術手段對差異區(qū)域內潛在的轉錄因子結合位點進行驗證。本試驗結果可為豬MITF基因的表達機制研究奠定基礎，也為深入研究豬毛色變化的調控機理提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物 采集3只榮昌豬新生小母豬耳組織樣，提取基因組DNA，用于擴增MITF-M基因的轉錄調控區(qū)。榮昌豬來自重慶市畜牧科學院安富豬場。

1.1.2 細胞 B16細胞(小鼠黑色素瘤細胞系)、貼壁細胞購于上海酶研生物科技公司。

1.1.3 試劑 DNA提取試劑盒、RNA提取試劑盒、Q5超保真DNA聚合酶和內切酶均購自NEB公司；蛋白酶K、GoTaq?qPCR Master Mix和雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)試劑盒購自Promega公司；膠回收試劑盒和質粒提取試劑盒購自Omega公司；干擾RNA購自Ribobio公司；Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；瓊脂糖、DNA marker購自TaKaRa公司。

1.2 試驗方法

1.2.1MITF-M基因轉錄調控區(qū)克隆以及5′端缺失重組載體構建 本試驗以榮昌豬DNA為模板，采用PCR擴增得到6 414 bp的MITF-M轉錄調控區(qū)域。50 μL反應體系：5×Q5 reaction buffer 10 μL，dNTP mixture(2.5 mmol·L-1)1 μL, Q5高保真酶(10 U·μL-1)0.5 μL,正、反向引物(10 μmol·L-1) 各1.5 μL，ddH2O 35.5 μL。PCR反應程序：98 ℃ 30 s；98 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 4 min，35個循環(huán)；72 ℃ 5 min。為了進一步產(chǎn)生后續(xù)的克隆片段，將XhoI和NheI兩個酶切位點加到引物的5′端。再以6 414 bp片段為模板，成功擴增另外8個5′端缺失片段，大小分別為1 140、1 397、 2 470、 3 753、5 201、5 429、 6 036 和 6 274 bp。隨后將所有片段經(jīng)過XhoI和NheI酶切后，利用T4連接酶亞克隆到pGL3-basic骨架載體上，構建了9個調控區(qū)5′端缺失重組載體：pGL3-1140、pGL3-1397、pGL3-2470、pGL3-3753、pGL3-5201、pGL3-5429、pGL3-6036、pGL3-6274、pGL3-6414，再通過測序和酶切電泳鑒定(圖1)，確認載體構建成功。所用引物信息見表1。

1.2.2MITF-M轉錄調控區(qū)生物信息學分析 從ENSEMBL(http://www.ensembl.org)數(shù)據(jù)庫中得到了其他4個物種(人、鼠、牛、狗)的MITF-M轉錄調控區(qū)序列；在線軟件Neural Network Promoter Prediction(http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)用于預測MITF-M轉錄調控區(qū)核心啟動子；MEME在線軟件(http://meme-suite.org/tools/meme)發(fā)掘5個物種間MITF-M轉錄調控區(qū)保守的序列(Motif)；在線軟件JASPAR(http://jaspar.genereg.net/)用于預測轉錄因子結合位點。

圖1 豬MITF-M轉錄調控區(qū)域重組載體酶切電泳圖
Fig.1 Enzyme digestion electrophoresis of pig MITF-M transcriptional regulatory regions

表1MITF-M重組載體構建引物

Table1PrimersforthevectorsconstructionofMITF-M

引物名稱Name引物序列(5′→3′)Sequence產(chǎn)物長度/bpLength重組載體Recombinant plasmidTSSR+Xho ⅠCCGCTCGAGCGGccggaaactttatcacagcagctc-1140F+Nhe ⅠCTAGCTAGCTAGtgtctggaccctttatgaaactcaca1 140pGL3-1140-1397F+Nhe ⅠCTAGCTAGCTAGaagcttactctgataaccccaactta1 397pGL3-1397-2470F+Nhe ⅠCTAGCTAGCTAGatggccactttatattaaggactttg2 470pGL3-2470-3753F+Nhe ⅠCTAGCTAGCTAGcaaacagtggatggactaggaggact3 753pGL3-3753-5201F+Nhe ⅠCTAGCTAGCTAGgcattttcattcttttaacggctgag5 201pGL3-5201-5429F+Nhe ⅠCTAGCTAGCTAGagtcccaaactcctaatttatccttc5 429pGL3-5429-6036F+Nhe ⅠCTAGCTAGCTAGgcttctacatgataggaaaattggat6 036pGL3-6036-6274F+Nhe ⅠCTAGCTAGCTAGcatacacacttctatgaattcctcct6 274pGL3-6274-6414F+Nhe ⅠCTAGCTAGCTAGctttccagagttgctggaagttttgt6 414pGL3-6414

引物序列中的大寫字母為限制性酶切位點；TSS代表轉錄起始位點

Uppercase letters in the primer sequences are restriction sites andTSSrepresent transcription start site

1.2.3MITF-M轉錄調控區(qū)活性分析 采用脂質體LipofectamineTM2000轉染試劑將構建好的MITF-M轉錄調控區(qū)域9個重組載體(每孔1 000 ng)和陰性對照pGL3-basic(每孔1 000 ng)分別與內參載體pRL-TK(每孔700 ng)共轉染到B16細胞內，48 h后裂解細胞，采用Promega公司的雙熒光素酶活性檢測試劑盒及Thermo公司的熒光和化學發(fā)光檢測儀(Thermo Scientific FLuoroskan Ascent FL)來測量分析。用每個孔的海腎熒光素酶發(fā)光值(pRL-TK)為內參校正螢火蟲熒光素酶發(fā)光值(重組載體)，得到每個重組載體的轉錄活性值，再除以陰性對照pGL3-basic的活性值獲得每個重組載體的相對轉錄活性值。

1.2.4 轉錄因子KLF4和Meis1干擾RNA試驗 由于在本試驗研究過程中篩選出可能影響MITF-M轉錄的兩個調控因子，故設計了KLF4和Meis1基因干擾RNA的試驗(表2)，分別將其與重組載體和內參載體pRL-TK共轉染到B16細胞內，48 h后收集細胞分成兩份，一份用于上述的雙熒光素酶活性檢測，獲得重組載體的轉錄活性值；另一份用于提取RNA，反轉錄成cDNA，再進行RT-PCR檢測干擾RNA的基因干擾效率，10 μL反應體系：GoTaq?qPCR Master Mix(2×)5 μL，正、反向引物(10 μmol·L-1)各0.2 μL，CXR 0.1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 3.5 μL。反應程序：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)，其中KLF4正向引物：5′-GCCGCTCTCGCTTATCTTCG-3′，反向引物：5′-GTCTTGCTACCCTGCTCCTT-3′；Meis1正向引物：5′-AAGCAGTTGGCACAAGATACAGGA C-3′，反向引物：5′-TGACTGCTCGGTTGGACTGG-3′。采用2-△△Ct方法計算KLF4和Meis1基因表達量。

表2KLF4和Meis1基因的干擾RNA序列

Table2TheinterferingRNAsequencesofKLF4andMeis1genes

名稱Name序列(5′→3′) Sequence正義鏈 Sense反義鏈 AntisensesiKLF4-1CACCCACACUUGUGACUAUTTAUAGUCACAAGUGUGGGUGTTsiKLF4-2GGUCAUCAGUGUUAGCAAATTUUUGCUAACACUGAUGACCTTsiMeis1-1GCUUUAAAGAGAGAUAAAGTTCUUUAUCUCUCUUUAAAGCTTsiMeis1-2AUGAAGAUAUAGCGGUGUUTTAACACCGCUAUAUCUUCAUTT

1.2.5 統(tǒng)計分析 使用Excel2013進行試驗數(shù)據(jù)整理，用SPSS19軟件中的Student′st-test或ANOVA進行差異顯著分析，使用Publisher2013作圖。

2 結 果

2.1 物種間MITF-M轉錄調控區(qū)生物信息學分析

本試驗以榮昌豬DNA為模板，采用巢式PCR成功擴增出MITF-M轉錄起始位點(TSS)前6 414 bp調控區(qū)域。把6 414 bp的DNA序列輸入在線軟件Neural Network Promoter Prediction，預測發(fā)現(xiàn)4個核心啟動子，都位于TSS～-1 427 bp內(表3)。

隨后構建了豬與其他4個物種(人、小鼠、牛、狗)MITF-M6 414 bp調控區(qū)序列的進化樹，發(fā)現(xiàn)豬和牛的親緣關系較近，與小鼠最遠(圖2b)。同時，利用MEME軟件分析5個物種間保守的序列模塊(Motif)，每一個Motif都可能存在與轉錄調控區(qū)域功能相關的調控序列。MEME分析結果表明(圖2a)，5個物種MITF-M轉錄調控區(qū)域序列存在規(guī)律性簇狀排列的Motifs，比如，TSS～-1 100 bp區(qū)域內包括Motif 1、3、4、7、8、11、13，除了小鼠缺失Motif 8外，其他Motifs在物種間分布保守；在-1 200 ～-1 400 bp區(qū)域內也包括3個分布保守的Motif 2、5、10；而從-1 400 bp到-4 830 bp，Motif 6、9、12、14、15在物種間的分布出現(xiàn)較大的差異，同時小鼠缺失Motif 6、12、15。

通過上述生物信息學的分析發(fā)現(xiàn)，TSS～-1 400 bp區(qū)域存在大多數(shù)核心啟動子和保守的Motifs，暗示這個區(qū)域對MITF-M的轉錄調控至關重要。

表3豬MITF-M調控區(qū)域內核心啟動子分布

Table3ThedistributionofcorepromotersinMITF-Mregulatoryregion

起始位點/bpStart結束位點/bpEnd啟動子序列(5′→3′)Promoter sequence 分數(shù)Score (0～1)-1 427-1 377CTCAATTATTTAAAAAGGCACTGACAATAAAAGCTTACTCTGATAACCCC0.98-1 262-1 212AACATTTATTTTTAAATGTGCAGCCCTTTCTTTTTTAAGTGACATAGTGA0.86-1 001-951ATTCTTGTGCTTAAAATACCTCACCATTTCAGCAGTGAAAATCGGCCATT0.84-535-485AGGATGTTTGTACATATATCCAGCTGAGAATAAGATGCACATTGAGACCA0.88

a.MEME數(shù)據(jù)庫預測的保守Motif的分布情況，Motif 1至Motif 15表示調控區(qū)域存在的序列模塊(Motif)，保守的Motif用相同顏色表示，平均長度為50 bp，不同的顏色代表不同的Motif(TSS代表轉錄起始位點)；b. MEGA7構建的物種間系統(tǒng)發(fā)育樹
a.The distribution of conserved Motifs were predicted by MEME database, Motif 1 to 15 showed sequence modules existing in regulatory regions and conservative Motif had the same color, different Motifs were represented by different colored boxes, the average length of the Motif was 50 bp(TSS represented transcription start site); b. The Neighbor-joining phylogenetic tree was constructed using MEGA7 with 6 414 bp sequences of MITF-M
圖2 5個物種MITF-M 6 414 bp轉錄調控區(qū)的系統(tǒng)發(fā)育樹以及Motif分布情況
Fig.2 Phylogenetic tree and Motif composition of 6 414 bp promoter region of MITF-M in 5 species

2.2 豬MITF-M基因轉錄活性分析

為了確定豬MITF-M基因的重要轉錄區(qū)域，本試驗根據(jù)上述核心啟動子和Motif的分布情況，成功構建出9個5′端缺失重組載體，分別為pGL3-1140、pGL3-1397、pGL3-2470、pGL3-3753、pGL3-5201、pGL3-5429、pGL3-6036、pGL3-6274、pGL3-6414(圖1)。

通過細胞轉染試驗和雙熒光素報告基因試驗，得到了每個重組載體的相對轉錄活性值。如圖3所示，所有9個重組載體的轉錄活性都高于空載體pGL3-basic,但隨著插入片段5′端延長，MITF-M調控區(qū)域的轉錄活性發(fā)生了變化。相比pGL3-1140，pGL3-1397的活性有顯著的上升，說明片段-1 140～-1 397 bp內含有正向調控元件；pGL3-1397和pGL3-2470的活性沒有顯著差異，都具有很高的轉錄活性；而pGL3-2470和pGL3-3753之間的活性出現(xiàn)了顯著的下降，甚至高達5～6倍的活性變化，說明-2 470～-3 753 bp這個區(qū)域可能存在極強的負向調控元件；pGL3-3753、pGL3-5201、pGL3-5429之間的活性沒有顯著差異，而且維持較低的轉錄活性；但與pGL3-5429相比，pGL3-6036活性呈現(xiàn)顯著的上升，說明片段-5 429～-6 036 bp內含有正向調控元件；而pGL3-6036、pGL3-6274、pGL3-6414之間活性沒有顯著差異。

由此，鑒定出豬MITF-M基因3個重要的轉錄活性顯著變化的區(qū)域，兩個轉錄激活區(qū)域，一個轉錄抑制區(qū)域。

2.3 轉錄因子KLF4調控豬MITF-M基因轉錄活性

為了進一步確定上述顯著變化區(qū)域內的重要調控元件和轉錄因子，本試驗運用JASPAR軟件預測這3個區(qū)域中潛在的轉錄因子結合位點(表4)。轉錄因子KLF4預測得分最高，而且已有研究報道KLF4與黑色素的合成直接相關[11]；再結合前面MEME分析結果，發(fā)現(xiàn)只有轉錄因子Meis1的結合位點位于Motif(Motif 12)上；而且KLF4和Meis1均未報道參與MITF-M轉錄調控。

為了證實它們與MITF-M的轉錄調控關系，本試驗合成了KLF4和Meis1基因的干擾RNA各2條(siKLF4和siMeis1)(表2)，將其轉入B16細胞48 h 后，利用RT-PCR發(fā)現(xiàn)基因干擾效率均在90%以上(圖4)，其中siKLF4-1和siMeis1-2的干擾效率更高，可用于后續(xù)干擾試驗。隨后，MITF-M重組載體和干擾RNA(siKLF4-1或siMeis1-2)共轉染試驗發(fā)現(xiàn)，與對照組(無義干擾RNA)相比，干擾KLF4基因表達時，pGL3-2470 與pGL3-3753活性的比值有顯著的下降，由原來約5倍的比值下降到約3倍，說明KLF4確實負向調控這個區(qū)域的活性變化。然而，干擾Meis1后，pGL3-2470 與pGL3-3753活性的比值卻沒有發(fā)生顯著變化，說明Meis1對這個區(qū)域的活性沒有調控作用(圖5)。

A. 豬MITF-M調控區(qū)Motif分布圖以及5′截短片段示意圖；B.9個5′截短片段重組載體以及空載體pGL3-basic的轉錄活性，***表示P<0.001
A. The diagram of Motif distribution and 5′ truncated fragments in the regulaory region of pig MITF-M gene; B.The transcriptional activity of recombinant vectors containing 9 5′truncated fragments and pGL3-basic, *** indicate P<0.001
圖3 豬MITF-M調控區(qū)轉錄活性分析
Fig.3 The transcriptional activities of the pig MITF-M regulatory regions

由此，本試驗發(fā)現(xiàn)，KLF4可以通過兩種不同的結合序列對MITF-M轉錄活性起負向調控作用。

表4MITF-M轉錄調控區(qū)轉錄因子的預測結合位點

Table4TheputativebindingsitesoftranscriptionfactorsinthetranscriptionalregulatoryregionsofMITF-M

區(qū)域/bpRegion轉錄因子Transcription factor預測分數(shù)MCS起始/bpStart結束/bpEnd預測位點序列Predicted site sequence-2 470～-3 753KLF415.416-2 836-2 827TGGGTGTGGCBhlha1513.595-2 846-2 839CCATATGTSox510.898-2 768-2 762ATTGTTASox510.898-2 739-2 733ATTGTTTMeis110.323-3 526-3 520TTGACAGNFIC9.697-3 177-3 172TTGGCAMZF19.085-2 664-2 659TGGGGASOX108.910-2 816-2 829CTTTGTMAFG::NFE2L18.812-2 840-2 835CATGAC

(續(xù)表4 Continued)

圖4 KLF4和Meis1干擾RNA在B16細胞中干擾基因表達的效率
Fig.4 The interference efficiency of siKLF4 and siMeis1 in B16 cells

**表示差異顯著(P<0.01)，下同
** indicate the significant difference(P<0.01),the same as below
圖5 KLF4 和Meis1干擾RNA對MITF-M轉錄活性的影響
Fig.5 Effect of siKLF4 and siMeis1 on the transcription activity of MITF-M

NS表示差異不顯著(P>0.05)
NS indicate the difference is not significant(P>0.05)
圖6 KLF4負向調控MITF-M轉錄
Fig.6 Negative effect of KLF4 on the transcription activity of MITF-M

3 討 論

毛色是豬的一個重要形態(tài)學特征，由表皮、毛囊內黑色素細胞的分布和活性決定。而MITF-M基因控制著黑色素細胞的色素合成和沉積，被視作毛色主要調控因子。MITF-M調控著大量與色素合成和黑色素細胞分化相關的基因，同時還控制著黑色素瘤細胞的增殖、浸潤和轉移。Chen等[11]發(fā)現(xiàn)，敲除MITF-M的轉基因小鼠，毛色出現(xiàn)全白的現(xiàn)象，與此同時毛色相關基因的表達水平也發(fā)生顯著變化。同時已有大量研究表明，MITF-M的轉錄調控區(qū)與動物毛色的改變有著密切的聯(lián)系，在狗毛色的研究中發(fā)現(xiàn)，MITF-M的轉錄調控區(qū)4個位點的突變與狗的毛色變化高度相關[12-13]；馬MITF-M轉錄調控區(qū)近端的出現(xiàn)一個位點的插入突變導致了馬毛色變化[14-16]；不同毛色的豬全基因組關聯(lián)分析證明，MITF所在區(qū)域與毛色高度相關[17-18]，而且豬MITF-M轉錄調控區(qū)遠端出現(xiàn)一個沉默子，導致MITF-M的表達缺失，從而引起毛色白化現(xiàn)象。這一切都證明MITF-M的轉錄調控區(qū)對動物毛色的重要性。本試驗獲得了豬MITF-M6 414 bp的轉錄調控區(qū)，生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，MITF-M的啟動子都位于TSS～-1 427 bp內，符合大多數(shù)基因啟動子的分布，而這個區(qū)域包含了絕大多數(shù)Motifs的分布，后續(xù)的雙熒光素報告基因試驗也證明了pGL3-1397的轉錄活性是最高的，說明這段區(qū)域對于啟動MITF-M的轉錄極為重要，這與Chen等[18]對MITF-M的研究結果相符。本研究中，在MITF-M基因的-1 140～-1 397 bp之間轉錄活性有顯著的變化，但當干擾到結合在Motif 2上的轉錄因子的表達后，pGL3-1397的活性顯著上升，說明物種間保守的Motif 2可能對MITF-M轉錄起著重要作用。本試驗還發(fā)現(xiàn)，在pGL3-2470和pGL3-3753之間存在著一個高達5～6倍的轉錄活性變化，后續(xù)試驗證實，干擾KLF4表達后，活性比值只減小到3倍，說明 片段-2 470～-3 753 bp之間還存在其他轉錄因子結合位點，有待進一步挖掘。除此之外，-5 429 ～-6 036 bp之間也出現(xiàn)轉錄活性顯著變化，但此區(qū)域并未發(fā)現(xiàn)Motif的分布，說明這有可能是豬特有的調控區(qū)域。

目前研究發(fā)現(xiàn)，PAX3、SOX10、CREB等轉錄因子和典型的WNT3A信號通路都能夠調控MITF-M的轉錄和表達[19-20]。本試驗發(fā)現(xiàn)了KLF4與MITF-M的轉錄調控關系。KLF4(Kruppel-like factor 4)作為真核生物轉錄因子，是一種在人類多種組織中廣泛表達的轉錄因子，參與調控細胞增殖、分化、胚胎發(fā)育等重要生命過程[21]。KLF4是一個雙重功能轉錄因子，根據(jù)不同的靶基因，通過不同的機制，既可以激活又可以抑制轉錄作用。但KLF4在不同的腫瘤中是作為癌基因或腫瘤抑制因子起作用的[22]。本試驗發(fā)現(xiàn)，在小鼠黑色素瘤細胞中轉錄因子KLF4對MITF-M基因轉錄有抑制作用，符合前人的研究結果。同時KLF4是體細胞重編程過程中誘導多能干細胞(iPS細胞)的重要誘導因子之一[23]，通過與轉錄調控區(qū)結合元件(GC盒、CACCC盒和基礎轉錄元件)結合來調控靶基因的轉錄[24]。本試驗發(fā)現(xiàn)，KLF4通過兩個結合位點來調控MITF-M轉錄活性，一個是近端(-1 140～-1 397 bp)的CACCC盒，一個是遠端(-2 470～-3 753 bp)的GC盒，完全符合已有研究結果。除此之外，Peagaricano等[25]研究發(fā)現(xiàn)，KLF4的表達量與黑色素的生成有直接關系，與本試驗的研究結果相結合可推測，KLF4通過抑制MITF-M的轉錄活性從而影響黑色素細胞的色素合成和沉積。

4 結 論

本研究發(fā)現(xiàn)了豬MITF-M基因3個重要的轉錄調控區(qū)域，2個正向調控區(qū)域，1個負向調控區(qū)域，還確定了KLF4抑制MITF-M轉錄活性的調控關系，為進一步研究MITF-M基因調控豬毛色的分子遺傳機制奠定了理論基礎。