陳玲玲 左 揚 馮 源 程錦國△

（1.浙江中醫(yī)藥大學附屬溫州市中醫(yī)院，浙江 溫州 325000；2.溫州醫(yī)科大學，浙江 溫州325000）

膜性腎?。∕N）是成人腎病綜合征的主要病因［1］，臨床上主要表現(xiàn)為蛋白尿或者腎病綜合征。近年來其發(fā)病率逐漸上升，成為繼IgA腎病后我國慢性腎臟病病理類型的又一大構成，并且年輕人的發(fā)病率在不斷增高［2-3］。膜性腎病的病理表現(xiàn)多為腎小球基底膜（GBM）增厚以及上皮下免疫復合物的沉積［4-5］?，F(xiàn)代醫(yī)學治療膜性腎病采用免疫抑制劑、糖皮質激素聯(lián)合細胞毒類藥物以及利妥昔單抗［6-7］等治療，存在治療費用昂貴，副作用大，療效欠佳等問題。近年來中醫(yī)學在膜性腎病的治療及延緩其進展方面的研究也取得了較多的成果。益氣活血化瘀湯是程錦國教授在中醫(yī)理論指導下制定的自擬方，具有益氣升陽、活血化瘀、清熱燥濕的功效，在臨床上治療膜性腎病有較好的療效。本研究旨通過被動性Heymann腎炎大鼠模型［8］，觀察益氣活血化瘀湯對膜性腎病的影響及可能機制，為臨床防治膜性腎病尋找新的途徑和干預靶點以及提供實驗材料支持。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性健康SD成年大鼠36只，體質量（150±20）g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號：SCXK（滬）2015-0009，飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學SPF級動物房。飼養(yǎng)溫度維持在20℃，分籠飼養(yǎng)，標準動物干飼料喂養(yǎng)，自由進水。

1.2 試藥與儀器 益氣活血化瘀湯（組成：黃芪30 g，炒白術 20 g，黨參 20 g，茯苓 30 g，當歸 12 g，陳皮12 g，忍冬藤 30 g，澤瀉 30 g，漏蘆 30 g，菝葜 20 g，黃柏10 g，天龍1 g）經常規(guī)煎煮、過濾、水浴蒸發(fā)等步驟，濃縮至生藥含量分別為 2.083、4.166、8.332 g/mL規(guī)格，由浙江中醫(yī)藥大學飲片廠炮制中心提供；洛丁新片（鹽酸貝那普利片，北京諾華制藥有限公司，批號：X2342）。 抗 Fx1A 抗血清 （25 mL，PTX-002S，Probetex）、抗 Podocin 抗體（100μL，ab181143，abcam）、FITC標記抗大鼠 IgG（100 μL，WD-0294R，達文生物）、C3抗體 （200 μg，sc-28294，Santa Cuz）、AF488 標記抗鼠二抗（100 μL，DW-GAM4881，達文生物）、DAB 顯色試劑盒、超敏二步法免疫組化檢測試劑盒 （ZLI-9018，PV-6001，北京中杉金橋公司）。光學顯微鏡、病理切片機（德國Leica公司）；微量加樣槍（德國Eppendorf公司）；全自動生化分析儀 （美國Beckman公司Coulter AU5800）。

1.3 造模與分組 雄性SPF級SD大鼠36只，適應性喂養(yǎng)1周并檢測24 h尿蛋白定量均小于10 mg后開始造模。將實驗大鼠隨機分為空白對照組6只及造模組30只。造模組大鼠給予一次性尾靜脈注射抗Fx1A血清0.6 mL/100 g體質量，空白對照組大鼠給予一次性尾靜脈注射0.9%氯化鈉注射液0.6 mL/100 g體質量，7 d后檢測24 h尿蛋白定量＞10 mg則為模型建立成功。造模成功的大鼠隨機均分為5組，即模型組、洛丁新組、益氣活血化瘀湯低、中、高劑量組，每組6只。造模過程中死亡的大鼠給予隨機補充，使每組均保持在6只。

1.4 干預方法 造模成功后即造模后第7天開始灌胃。正常對照組、模型組給予0.9%氯化鈉注射液10 mL/kg體質量；洛丁新組給予洛丁新片0.8 mg/kg（0.8 mg/mL）體質量；益氣活血化瘀湯的給藥劑量為10 mL/kg體質量，其高、中、低劑量分別按照體質量為60 kg的成人每日生藥量的20、10、5倍（灌胃生藥含量分別為8.332、4.166、2.083 g/mL的濃縮液）計算。各組均給藥4周。

1.5 標本采集與檢測 分別用代謝籠收集造模后第7、14、21、28、35 天的 24 h 尿液，記錄尿量，離心沉淀后去上層清液檢測24 h尿蛋白定量。在造模第35天處死大鼠，采用10%水合氯醛3.5 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，用采血針心臟取血，3500 r/min、5 min離心后取上層血清用于檢測生化指標。摘取大鼠兩邊腎臟，去掉包膜，分切腎組織，分別置于4%多聚甲醛溶液中室溫固定，用0.9%氯化鈉注射液浸濕的紗布包裹，-20℃凍存，剩余腎臟組織置于液氮中速凍保存。1）血尿生化檢測：將收集的24 h尿液采用免疫比濁法測24 h尿蛋白定量；心臟取血收集的血液送檢至溫州市中醫(yī)院檢驗科，檢測血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、血清總蛋白（TP）、血清白蛋白（ALB）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、三酰甘油（TAG）。2）腎臟組織病理學檢測：腎臟組織用4%多聚甲醛溶液室溫固定24 h，經常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋制成蠟塊后切片成3 μm石蠟切片，按常規(guī)方法進行HE、Masson、PASM染色，光鏡下觀察腎臟組織病理學改變。3）免疫組化檢測：石蠟切片后常規(guī)脫蠟至水，過氧化氫室溫浸泡10 min后蒸餾水洗，高溫高壓抗原修復，冷卻至室溫后PBS洗3次，每次 5 min，滴加一抗，抗 Podocin 抗體（1∶500）4 ℃過夜。超敏二步法免疫組化檢測法，滴加二抗，室溫孵育 20 min，PBS洗 3次，每次 5 min，DAB 顯色 3.5 min，自來水沖洗、蘇木素復染、鹽酸酒精分化、水洗返藍、脫水、透明、封片。400倍光鏡下觀察，每張切片隨機取上、下、左、右、中5個不重疊視野，拍照；采用Image Pro Plus 6.0軟件對采集的圖像進行累積光密度值（IOD值）進行分析，用以檢測Podocin抗體的表達量。4）免疫熒光檢測：大鼠腎臟組織切片至4 μm冰凍切片，PBS浸洗 20 min，滴加一抗，37℃孵育 2 h，PBS洗3次，各5 min，其中IgG為直接免疫熒光抗體，直接滴加甘油封片；滴加二抗，37℃孵育2 h，PBS洗3次，各5 min，封片。熒光顯微鏡下觀察IgG和C3的沉積情況。

1.6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，多個樣本均數比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用最小顯著差法（LSD），方差不齊時采用Dunnett T3檢驗。P＜0.05或P＜0.01為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 動物一般情況 正常對照組大鼠狀態(tài)良好，活潑好動，毛發(fā)光滑，進食正常。造模組大鼠出現(xiàn)不同程度的精神萎靡，毛發(fā)光澤度減弱，毛發(fā)脫落，進食減少。

2.2 各組大鼠24 h尿蛋白定量和血生化指標改變見表1～表2。造模7 d后，模型組、洛丁新組及益氣活血化瘀湯各劑量組的24 h蛋白尿定量明顯高于正常對照組（P＜0.05）。造模21 d后，洛丁新組及益氣活血化瘀湯各劑量組的24 h蛋白尿定量開始減少。造模35 d后洛丁新組及益氣活血化瘀湯各劑量組的24 h蛋白尿定量明顯低于模型組（P＜0.05），益氣活血化瘀湯各劑量組24 h蛋白尿低于洛丁新組，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。益氣活血化瘀湯低、中、高劑量組之間比較，24 h尿蛋白定量差異無統(tǒng)計學意義 （P＞0.05）。各組大鼠的生化水平比較，造模后，大鼠TP、ALB較正常組降低，洛丁新組及益氣活血化瘀湯各劑量組較模型組升高，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；其余生化指標水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠24 h蛋白尿定量比較（mg，±s）

表1 各組大鼠24 h蛋白尿定量比較（mg，±s）

與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。下同

組 別 n正常對照組 6模型組 6洛丁新組 6 2 8 d 3 5 d 1 2.1 3±2.1 8 1 1.5 7±1.6 8 5 2.8 4±1 1.7 0* 5 4.0 5±8.5 7*4 3.0 9±8.7 0* 3 6.9 7±6.5 4*△益氣活血化瘀湯低劑量組 6 2.7 5±1.3 7 5 3.0 4±2 2.2 2* 5 1.0 1±1 5.5 1* 4 0.5 7±1 0.6 3* 3 5.0 1±8.8 3* 3 0.0 3±5.5 4*△益氣活血化瘀湯中劑量組 6 2.4 8±1.3 7 5 5.9 5±1 6.6 1* 5 6.0 9±1 4.0 1* 3 8.8 3±9.3 7* 3 2.1 8±9.0 3* 2 8.0 6±9.2 4△益氣活血化瘀湯高劑量組 6 2.8 8±1.0 4 5 3.8 6±1 6.5 5* 5 3.8 7±1 7.9 0* 3 8.7 3±6.9 6* 3 1.6 0±3.8 1* 2 9.8 2±2.9 7*△0 d 7 d 1 4 d 3.6 2±1.5 2 4.6 9±2.1 1 9.4 9±4.4 5 2.5 4±1.1 4 6 5.7 3±2 9.9 6* 7 3.9 1±3 3.7 8*2.3 6±0.5 6 6 4.2 4±2 7.5 6* 6 7.4 2±2 6.4 8*2 1 d 1 4.5 2±3.3 7 6 4.9 8±2 3.9 1*6 0.2 9±1 9.1 0*

表2 各組大鼠生化水平比較（±s）

表2 各組大鼠生化水平比較（±s）

?組 別 n正常對照組 6模型組 6洛丁新組 6 T C（m m o l/L）1.6 1±0.2 0 1.8 1±0.4 6 2.1 2±0.3 9益氣活血化瘀湯低劑量組 6 5 5.6 5±2.1 2 3 6.5 0±1.7 0 3 0.1 7±5.5 3 5.9 0±0.9 0 1.8 7±0.3 0益氣活血化瘀湯中劑量組 6 5 4.4 0±2.2 0 3 6.2 8±1.1 2 3 0.5 0±6.1 9 6.2 1±0.9 7 1.8 6±0.7 3益氣活血化瘀湯高劑量組 6 5 5.4 2±2.3 0 3 6.8 3±2.0 7 2 8.0 0±6.3 2 5.6 7±1.2 6 1.8 7±0.5 6 T P（g/L） A L B（g/L） S c r（μ m o l/L）5 5.5 0±1.2 2 3 7.9 5±2.6 2 3 0.3 3±1 1.1 3 5 3.5 3±3.1 0 3 5.5 3±2.5 2 2 8.8 3±5.9 8 5 3.8 3±1.7 8 3 6.7 3±2.7 7 3 0.3 3±9.1 4 B u n（m m o l/L）5.7 2±1.6 3 5.7 5±1.1 1 6.1 1±1.1 2 H D L-C（m m o l/L） T A G（m m o l/L）0.5 6±0.0 5 0.3 5±0.1 5 0.5 8±0.0 8 0.3 5±0.0 8 0.6 8±0.0 3 0.3 9±0.1 6 0.6 4±0.1 3 0.3 3±0.1 3 0.6 4±0.1 5 0.3 4±0.1 6 0.6 1±0.1 2 0.2 8±0.0 7

2.3 各組大鼠腎臟組織病理改變 見圖1～圖3。HE染色結果顯示，正常對照組腎組織未見明顯的病理學改變；造模組腎小球體積增大，腎小球毛細血管壁有不同程度的增厚，血管腔開放良好，系膜細胞及系膜基質增生。Masson染色結果顯示，造模組腎小球上皮下有大量嗜復紅蛋白沉積；PASM染色結果顯示，造模組腎小球毛細血管壁增厚，部分腎小球基底膜增厚，內皮細胞增生，上皮下有“釘突”形成，部分小管內皮細胞脫落，刷狀緣消失。

圖1 各組大鼠腎臟組織病理學改變（HE染色，400倍）

2.4 各組大鼠腎臟組織免疫熒光IgG和C3沉積情況見圖4～圖5。正常對照組顯示IgG和C3均為陰性；模型組及洛丁新組、益氣活血化瘀湯各劑量組顯示IgG和C3均沿腎小球毛細血管壁呈細顆粒狀沉積；IgG免疫熒光結果顯示，模型組及洛丁新組的熒光強度為（+++～++++），益氣活血化瘀湯各劑量組的熒光強度為（+～++），其中低劑量組及中劑量組的熒光強度較高劑量組弱。C3免疫熒光結果顯示，模型組及益氣活血化瘀湯各劑量組的熒光強度為（++～+++），較模型組弱，益氣活血化瘀湯各劑量組之間無明顯差異，洛丁新組熒光強度為（+）。

圖2 各組大鼠腎臟組織病理學改變（Masson染色，400倍）

圖3 各組大鼠腎臟組織病理學改變（PASM染色，400倍）

圖4 各組大鼠腎組織免疫熒光C3沉積情況（400倍）

2.5 各組大鼠腎臟組織Podocin陽性表達情況比較見圖6，表3。與正常對照組比較，模型組Podocin表達明顯減少（P＜0.01）。與模型組比較，洛丁新組及益氣活血化瘀湯各劑量組Podocin表達都較模型組升高，其中益氣活血化瘀湯各劑量組較洛丁新組升高明顯（P＜0.01），益氣活血化瘀湯各劑量組之間的差異無統(tǒng)計學意義。

表3 各組大鼠腎臟組織Podocin表達情況比較（±s）

表3 各組大鼠腎臟組織Podocin表達情況比較（±s）

與洛丁新組比較，＃P＜0.01

?組 別正常對照組模型組洛丁新組P o d o c i n I O D 1 2 7 0 4.1 8±4 1 1 0.3 6△3 9 6 2.8 9±2 4 4 8.3 0*6 3 6 2.6 7±6 0 0 1.4 8*益氣活血化瘀湯低劑量組 1 2 4 2 6.0 0±3 4 5 2.8 4△＃益氣活血化瘀湯中劑量組 1 2 2 9 2.6 7±3 7 7 4.4 5△＃益氣活血化瘀湯高劑量組 1 6 0 5 2.6 2±7 5 9 4.2 9△＃

圖6 各組大鼠腎臟組織免疫組化Podocin表達情況（400倍）

3 討 論

膜性腎病臨床多表現(xiàn)為蛋白尿，而蛋白尿持續(xù)性增加作為腎損傷標志，對腎臟疾病的治療和預后判斷有具有指導意義［9］。近年來，許多研究表明蛋白尿的產生與腎小球濾過屏障有著密切的關系，而足細胞裂孔膜（SD）作為腎小球濾過屏障的重要組成部分［10-11］，與蛋白尿的產生息息相關［12］，是近年來的一大研究熱點。Podocin是足細胞裂孔膜的重要組成部分之一，它以發(fā)夾樣結構插入足突膜，與Nephrin及CD2AP等其他蛋白配合作用，共同維持裂孔膜構造和功能的完整性［13-14］。有研究表明［15］，在 Heymann 早期免疫熒光染色顯示Podocin已經從現(xiàn)狀變成粒狀，Podocin的表達減少以及它與Nephrin的分離可能促進了蛋白尿在膜性腎病中的發(fā)展；Podocin在特發(fā)性膜性腎病和繼發(fā)性膜性腎病中均表達減少，其表達改變可能是導致腎小球濾過屏障受損，產生大量蛋白尿的直接原因［16］。以上都說明了膜性腎病蛋白尿的產生可能與腎臟組織Podocin蛋白的表達減少有關。

中醫(yī)學古籍中并無膜性腎病的記載，根據其臨床特征可大致歸屬于中醫(yī)學的“水腫”“尿濁”“腰痛”等病證范疇。許多醫(yī)家認為，膜性腎病的病機特點是本虛標實，本虛主要是脾腎兩虛，標實是濕熱、水濕、瘀血等［17-18］。益氣活血化瘀湯為本文通信作者程錦國教授的自擬方，程錦國教授認為膜性腎病多系肺、脾、腎虛損，水液及氣血運行失常，引起水濕、濕熱、濁毒等壅結于內，進一步導致瘀血內停，精微外泄［19］。方中黃芪、黨參補氣升陽、健脾益肺為君，白術、茯苓健脾滲濕，當歸養(yǎng)血補血活血，使活血而血不妄行，散瘀而正氣不損，陳皮理氣燥痰化濕為臣藥，忍冬藤、澤瀉、漏蘆、黃柏清熱解毒燥濕，天龍活絡散結，使氣行則血行。諸藥合用共奏益氣升陽、活血化瘀、清熱燥濕之功。

本實驗研究結果表明，益氣活血化瘀湯可以上調膜性腎病大鼠Podocin蛋白的表達，減少膜性腎病大鼠蛋白尿的產生，在一定程度上維持足細胞結構的正常以及腎小球濾過屏障功能的完整性，從而達到保護腎臟功能，延緩腎臟病理改變。這可能是益氣活血化瘀湯對膜性腎病的作用機制之一，其對足細胞以及腎小球濾過屏障功能的其他作用機制仍需要進一步探索。