楊 燕，田 鴻*，張小平，毋校輝，羅金洲

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源學(xué)院，四川 成都 611130；2.四川菌之味農(nóng)業(yè)科技有限公司，四川 成都 611130)

【研究意義】羊肚菌屬于子囊菌門(Ascomycota)，盤菌綱(Pezizomycetes)，盤菌目(Pezizales)，羊肚菌科(Morchellaceae)，羊肚菌屬(Morchella)，是一種珍惜名貴的食用菌，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，被稱之為“菌中之王”，備受人們喜愛[1]。長(zhǎng)久以來(lái)，市場(chǎng)主要以野生羊肚菌采集為主，隨著消費(fèi)和認(rèn)知水平的擴(kuò)大，野生羊肚菌已經(jīng)無(wú)法滿足市場(chǎng)需求，國(guó)內(nèi)不少地區(qū)已出現(xiàn)野生羊肚菌產(chǎn)量明顯下降趨勢(shì)。可喜的是，在全球蘑菇愛好者和我國(guó)菇民朋友的不懈努力下，羊肚菌人工栽培取得了長(zhǎng)足進(jìn)展，特別是近年來(lái)發(fā)源自我國(guó)川渝地區(qū)的羊肚菌大田栽培技術(shù)，逐漸成熟并推廣至全國(guó)各地，實(shí)現(xiàn)了羊肚菌的商業(yè)化栽培[2]。羊肚菌馴化栽培道路艱辛而漫長(zhǎng)的一個(gè)主要原因是可栽培菌株的確定。美國(guó)的工廠化栽培菌株為變紅羊肚菌，而適應(yīng)于我國(guó)當(dāng)前栽培模式的菌株主要是黑色羊肚菌支系種類[3]，主要為梯棱羊肚菌(Morchellaimportuna)，六妹羊肚菌(Morchellasextelata)和七妹羊肚菌(Morchellaseptimelata)[4]。種質(zhì)資源研究匱乏、種性退化嚴(yán)重、同物異名和異物同名的現(xiàn)象[5]，這是制約我國(guó)羊肚菌穩(wěn)步發(fā)展的主要原因。【前人研究進(jìn)展】隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，羊肚菌多基因序列模標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)MLST[6](Multilocus sequence typing)的開發(fā)，眾多分子標(biāo)記技術(shù)廣泛應(yīng)用于羊肚菌的分子鑒定。劉叢文利用核糖rDNA內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal Transcribed Spacer，ITS)序列指導(dǎo)鑒定羊肚菌所屬物種[7]。Kerry O’Donnell等[8]人利用28S rDNA-RPB1-RPB2-EF-1α多基因序列聯(lián)合分析羊肚菌系統(tǒng)發(fā)育，最后將羊肚菌分為三大支系：黑色羊肚菌支系(Elata,Clade)、黃色羊肚菌支系(Esculenta Clade)和變紅羊肚菌支系(Rufobrunnea Clade), 杜習(xí)慧等[9]通過多基因序列研究中國(guó)羊肚菌，同樣將其分為以上三大支系，目前最具權(quán)威的分類體系。杜習(xí)慧等[10]利用羊肚菌交配型基因(Mating-Type locus,MAT)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，能很好區(qū)分近緣物種，分析其親緣關(guān)系，對(duì)指導(dǎo)種質(zhì)鑒定具有重要意義。目前商業(yè)化栽培的羊肚菌大部分是黑色羊肚菌支系，而黃色羊肚菌支系和變紅羊肚菌支系的羊肚菌未有成功商業(yè)化栽培的報(bào)道。學(xué)者們從各地采集野生羊肚菌，馴化人工栽培，鑒定羊肚菌所屬種類，這有利于選育適合人工栽培的菌株。 國(guó)內(nèi)關(guān)于羊肚菌遺傳多樣性研究的報(bào)道較少，劉文叢[11]利用ISSR(Inter-Simple Sequence Repeat)分子標(biāo)記方法對(duì)滇西北地區(qū)56株羊肚菌子實(shí)體進(jìn)行了遺傳多樣性及系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果表明，羊肚菌居群間的遺傳分化程度較大，而居群內(nèi)的遺傳分化程度相對(duì)較小。羊肚菌物種豐富，杜習(xí)慧等[12]第一次進(jìn)行了同區(qū)域2種羊肚菌種群間遺傳多樣性研究，結(jié)合分子標(biāo)記手段表明兩者有明顯的變異性，表明兩個(gè)同源物種具有不同的潛在進(jìn)化史。【本研究切入點(diǎn)】本研究以18株羊肚菌菌株(其中人工栽培菌株14株，菌株4株)為供試材料，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和ITS序列對(duì)供試菌株進(jìn)行鑒定，并構(gòu)建了供試菌株的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。結(jié)合ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)其進(jìn)行聚類分析，系統(tǒng)的對(duì)供試菌株間的種質(zhì)資源進(jìn)行分析?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究有助于羊肚菌遺傳育種工作的開展。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試菌株共計(jì)18株，具體信息見表1。

1.2 試劑與儀器

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、水1000 mL。主要試劑：葡萄糖、瓊脂粉、瓊脂糖(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；真菌基因組DNA抽提試劑盒(Ezup)、PCR MIX、DNA凝膠回收試劑盒及DNA Marker DL 2000 bp均購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；ITS1、ITS4和ISSR引物，均由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。主要儀器：研缽、恒溫培養(yǎng)箱、渦旋振蕩器、冷凍離心機(jī)、PCR儀、電泳儀、凝膠成像儀等。

表1 供試菌株

1.3 菌種活化及DNA的提取

將羊肚菌菌絲塊接種至新鮮PDA平板上，于22 ℃恒溫培養(yǎng)，待菌絲長(zhǎng)滿后備用。

取已經(jīng)準(zhǔn)備的羊肚菌菌絲體為材料，液氮研磨，按照真菌基因組DNA提取試劑盒上操作步驟提取供試菌株DNA。采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的濃度和純度，-20 ℃冰箱保持備用。

1.4 ITS基因PCR擴(kuò)增

ITS1:TCCGTAGGTGAACCTGCGG； ITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC。PCR反應(yīng)體系(50 μl)如下：2×TaqMix 25 μl，真菌通用引物(10 μM)ITS1和ITS4各1 μl，模板DNA加1 μl，加入22 μl ddH2O補(bǔ)齊體系。PCR程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，61 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共計(jì)35個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后再72 ℃延伸10 min，反應(yīng)結(jié)束。PCR產(chǎn)物于1.5 %的凝膠上電泳，電壓120 V，電泳20 min。用凝膠成像系統(tǒng)拍照并保存，用DNA凝膠回收試劑盒回收純化的片段，將其于擎科生物技術(shù)有限公司(成都)完成測(cè)序。

1.5 ISSR-PCR擴(kuò)增

參考劉文叢的文章[11]，經(jīng)過篩選出條帶清晰、重復(fù)性和穩(wěn)定性好且多肽條帶相對(duì)較多的引物用于羊肚菌遺傳多樣性分析，其引物ISSR1：AGAGAGAGAGAGAGAGC。ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(30 μl)：2×TaqMix 15 μl，ISSR引物(10 μM)1.5 μl，模板DNA 3 μl，加入10.5 μl ddH2O補(bǔ)足體系。PCR程序：95 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性1 min，48 ℃退火1 min，65 ℃延伸8 min，30個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后再65 ℃延伸16 min，反應(yīng)結(jié)束。取5 μl PCR產(chǎn)物于2 %的凝膠上電泳，電壓80 V，電泳1.5 h。將凝膠移至凝膠成像儀下觀察并照相保存。

1.6 數(shù)據(jù)分析

登錄NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，將所測(cè)得的羊肚菌ITS序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，下載相似度高的序列，用MEGA6.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，根據(jù)鄰近遺傳距離法(NJ法)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[13]，對(duì)結(jié)果進(jìn)行分類，結(jié)合形態(tài)特征分析，鑒定羊肚菌菌株。

ISSR標(biāo)記的電泳圖中每1個(gè)條帶代表引物的1個(gè)特異結(jié)合位點(diǎn)人工讀取電泳條帶，有擴(kuò)增條帶的為“1”，同一位置無(wú)條帶的為“0”，在EXCEL表中建立數(shù)據(jù)矩陣。采用NTSYS-pc2.1軟件計(jì)算樣品之間的相似系數(shù)，并進(jìn)行UPGMA(非加權(quán)算術(shù)平均聚類)進(jìn)行聚類分析[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 系統(tǒng)發(fā)育分析

我國(guó)目前的羊肚菌人工栽培菌株主要是梯棱羊肚菌和六妹羊肚菌[16]，其中梯棱羊肚菌的推廣應(yīng)用面積最大，野生梯棱羊肚菌主要集中在四川、云南、湖北、貴州等地。梯棱羊肚菌、六妹羊肚菌和高羊肚菌子實(shí)體形狀如圖1～3所示。

供試菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖4所示。9株來(lái)自不同地區(qū)的9株人工栽培菌株(YD9a、YD13、YD7、YD2、YD1、cang1、YD16、YD17、YD9b)和野生菌株GS(采自陜西)為梯棱羊肚菌。2株人工栽培菌株(12wen、1212M)為六妹羊肚菌；野生羊肚菌菌株1431B(采自成都大邑)、WL3(采自重慶武隆)和2株人工栽培菌株(cang2、YD6)為高羊肚菌(M.elata)。以上菌株均屬于黑色羊肚菌支系。而野生菌株LF(采自湖北恩施)和YD15(采自綿陽(yáng)平武)為粗柄羊肚菌(M.crassipes)[15]，屬于黃色羊肚菌支系。

圖1 梯棱羊肚菌Fig.1 Morchella importuna

圖2 六妹羊肚菌Fig.2 Morchella sextelata

2.2 ISSR-PCR聚類分析

利用已經(jīng)優(yōu)化的羊肚菌ISSR-PCR擴(kuò)增體系，對(duì)引物ISSR1進(jìn)行擴(kuò)增(圖5)，不同的菌株擴(kuò)增出的條帶具有明顯的差異，且多態(tài)性豐富，重復(fù)性強(qiáng)。

2.3 供試菌株ISSR聚類分析

采用UPGMA法構(gòu)建了羊肚菌菌株間聚類圖，如圖6所示，在相似系數(shù)0.54處可將18株羊肚菌分為2大類，即M1、M2、M9、M7、M12、M11、M8、M18、M10、M13、M6、M16、M5為1類；M3、M14、M4、M15、M17為1類。其中M7和M12相似系數(shù)高達(dá)99 %，兩者親緣關(guān)系最近；M1和M2相似系數(shù)高達(dá)95 %，M8和M18相似系數(shù)高達(dá)95 %，M6和M16相似系數(shù)高達(dá)95 %，他們之間遺傳關(guān)系比較近，而M1和M17遺傳關(guān)系最遠(yuǎn)。

3 討 論

羊肚菌是一種名貴的食用菌，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。其鮮品可以直接進(jìn)入消費(fèi)市場(chǎng)，也可以做成干品，便于運(yùn)輸和儲(chǔ)藏，其干品有種特殊的菌香味，深得消費(fèi)者喜愛[17]。目前羊肚菌已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了人工栽培，不會(huì)再因?yàn)橐吧蚨蔷南∪倍鵁o(wú)法滿足消費(fèi)者的需求，譚方河[18]闡述了羊肚菌栽培歷史，經(jīng)過不斷探索，栽培技術(shù)已有了很大的進(jìn)步。羊肚菌屬于子囊菌，遺傳特性不穩(wěn)定，在栽培過程中，學(xué)者們開始意識(shí)到菌種在羊肚菌馴化及栽培中的重要性，羊肚菌菌株退化后，栽培將面臨絕收的可能，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[19-21]。目前解決羊肚菌菌種穩(wěn)定性，主要從品種選育及馴化栽培，篩選出優(yōu)良性狀的菌株，同時(shí)研究羊肚菌種質(zhì)資源，生活史，菌種老化與退化，遺傳育種等基礎(chǔ)理論[22]。

圖3 高羊肚菌Fig.3 Morchella elata

加粗為供試菌株圖4 供試菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogeny tree constructed by the tested strains

圖5 18株羊肚菌擴(kuò)增ISSR圖譜分析Fig.5 ISSR profile of 18 Morchella strains

圖6 供試菌株ISSR聚類分析Fig.6 Cluster analysis of tested strains based on ISSR

羊肚菌的生長(zhǎng)易受到環(huán)境的影響，造成形態(tài)的多樣性，因此傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類法不能有效區(qū)分，分子生物學(xué)的發(fā)展，推動(dòng)了分子標(biāo)記法在菌株鑒定上的應(yīng)用。閆曉雪等[23]基于ITS序列，對(duì)西南地區(qū)部分野生羊肚菌鑒定，將供試菌株分為7個(gè)種類。本項(xiàng)研究采用ITS分子標(biāo)記手段結(jié)合形態(tài)特征對(duì)羊肚菌進(jìn)行鑒定，以確定分類地位。結(jié)果表明，8個(gè)人工栽培菌株和1個(gè)野生菌株鑒定為梯棱羊肚菌，2株人工菌株鑒定為六妹羊肚菌，2株人工栽培菌株和2株野生菌株鑒定為高羊肚菌，2株野生菌株鑒定為粗柄羊肚菌。目前的栽培技術(shù)，梯棱羊肚菌和六妹羊肚菌產(chǎn)量較高，已經(jīng)商業(yè)化推廣，因此，在收集野生菌株的時(shí)候，可以有目的的選擇梯棱羊肚菌和六妹羊肚菌進(jìn)行馴化，這樣選育出商業(yè)化品種成功的可能性更大，豐富栽培品種，解決羊肚菌退化及老化問題，促使羊肚菌行業(yè)穩(wěn)定發(fā)展。

近年來(lái)，由于全球氣候變化太大，加之人們過渡采集及不合理采集野生羊肚菌，其產(chǎn)量正逐年下降，為使羊肚菌資源得到可持續(xù)發(fā)展，需充分了解其物種遺傳多樣性。物種多樣性越豐富，對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)能力越強(qiáng)，生存能力和進(jìn)化潛力也就越大，進(jìn)而也就不容易成為瀕危物種[24]。ISSR分子標(biāo)記技術(shù)廣泛用于食用菌遺傳多樣性，不同的羊肚菌菌株的DNA序列存在差異，在ISSR-PCR 擴(kuò)增過程中，DNA序列與引物結(jié)合，不同的菌株出現(xiàn)不同的ISSR條帶，能反映出菌株間的遺傳多樣性。魏巍等[14]選擇了16個(gè)羊肚菌菌株，應(yīng)用ISSR-PCR技術(shù)討論了遺傳多樣性。本文對(duì)18株羊肚菌采用ISSR分子標(biāo)記方法，其供試菌株的電泳圖譜具有明顯的差異性，多態(tài)性豐富，重復(fù)性高。采用UPGMA法對(duì)羊肚菌聚類分析，結(jié)果表明相似系數(shù)小于0.52時(shí)，供試菌株聚為一類，相似系數(shù)為0.54時(shí)，聚為兩大類，說(shuō)明18株羊肚菌具有明顯的遺傳多樣性，在9個(gè)人工栽培梯棱羊肚菌菌株中，其中M1和M17遺傳差異最大，可能是由于它們生長(zhǎng)條件、生長(zhǎng)方式和生長(zhǎng)階段的不同導(dǎo)致，推測(cè)環(huán)境的影響對(duì)羊肚菌遺傳的變化有很大關(guān)系。

4 小 結(jié)

綜上所述，本文采用ITS和ISSR分子技術(shù)對(duì)18株羊肚菌進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育和遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，供試菌株鑒定為梯棱羊肚菌、六妹羊肚菌、高羊肚菌、粗柄羊肚菌，18個(gè)菌株具有明顯的遺傳多樣性。我國(guó)蘊(yùn)含豐富的羊肚菌種質(zhì)資源，可為人工馴化栽培和菌種選育提供大量素材，有利于羊肚菌產(chǎn)業(yè)長(zhǎng)遠(yuǎn)發(fā)展。