吳志倉(cāng) ，曹小安 ，林學(xué)仕 ，張俊文 ，張麗蓉 ，金淑霞

（1.甘肅省永靖縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，永靖 7316002；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，蘭州 730046）

布魯氏菌病在我國(guó)是人的乙類傳染病、家畜二類傳染病，也是WHO確認(rèn)的致殘率最高的動(dòng)物源性人畜共患病。畜間布病以牛羊?yàn)橹?，染疫家畜及其產(chǎn)品是人間布病的主要傳染源，牲畜養(yǎng)殖、畜產(chǎn)品加工、動(dòng)物防疫和布病防治工作人員是高發(fā)人群。布魯氏菌病不僅危害人體健康和畜牧業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展，同時(shí)還可導(dǎo)致食源性布病感染發(fā)生，引發(fā)新的食品安全問(wèn)題，嚴(yán)重影響社會(huì)穩(wěn)定和經(jīng)濟(jì)發(fā)展。為了查明甘肅省永靖縣奶牛感染布魯氏菌病的菌種和類型，為該地區(qū)布病科學(xué)防控提供技術(shù)支撐，2016年9月，作者等從永靖縣某奶牛養(yǎng)殖戶中檢測(cè)出的布病陽(yáng)性牛中采集病料，進(jìn)行了病原的分離與鑒定。

1 材料與方法

1.1 病料

3份疑似感染布魯氏菌病奶牛脾臟。

1.2 病料中基因組的提取

取米粒大小的脾臟放入離心管中，參照文獻(xiàn)［1］方法提取總基因組DNA，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR

用布魯氏菌Nested-PCR檢測(cè)病料中的細(xì)菌。

1.3.1 反應(yīng)體系

一擴(kuò)：10×PCR buffer（含 Mg2+）5 μL，dNTPs 4 μL，BP1 和 BP2 引物各 1 μL，模板 4 μL，無(wú)菌雙蒸水 35 μL。

二擴(kuò)：10×PCR buffer（含 Mg2+）5 μL，dNTPs 4 μL，BP3 和 BP4 引物各 1 μL，模板 2 μL，無(wú)菌雙蒸水 37 μL。

反應(yīng)時(shí)在體系中加入0.25 μLTaqDNA聚合酶。

1.3.2 反應(yīng)條件

一擴(kuò)：首先95℃充分變性5 min；94℃變性1 min，49℃退火 1 min，72℃延伸 1 min，35個(gè)循環(huán)，最后 72℃延伸10 min。

二擴(kuò)：94℃變性 30 s，51℃退火 1 min；最后72℃延伸1 min，20個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸6 min。

1.4 細(xì)菌的分離

將采集的病料取100 mg左右放置于1.5 mL離心管中，加入500 μL無(wú)菌生理鹽水用組織破碎儀破碎，5 000 r/min離心10 min，無(wú)菌條件下將沉淀均勻涂布在選擇性培養(yǎng)基平皿。將涂布好的平板置37℃、5%～10%CO2溫箱培養(yǎng)，每天觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況，記錄生長(zhǎng)菌落數(shù)量、顏色、大小、光滑度等，培養(yǎng)15 d無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)者為陰性。以接種針挑取選擇性培養(yǎng)平板單菌落，劃線接種于固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基，置37℃CO2溫箱培養(yǎng)，觀察純培養(yǎng)細(xì)菌在固體和液體培養(yǎng)基的生長(zhǎng)特性。

1.5 分離菌株的AMOS-PCR

1.5.1 引物

AMOS-（A1）：5’-gacgaacggaatttttccaat ccc-3’

AMOS-（M）：5’-aaatcgcgtccttgctggtctga-3’

AMOS-（O）：5’-cgggttctggcaccatcgtcg-3’

AMOS-（S）：5’-gcgcggttttctgaaggttcagg-3’

AMOS-（A2）：5’-gcgcagcgttgcggcaattg-3’

AMOS-（IS711）：5’-tgccgatcacttaagggccttcat-3’

1.5.2 AMOS-PCR體系與條件

EXTaq mix 25 μL，AMOS-（A1）1 μL，AMOS-（M）1.5 μL，AMOS-（O）1.5 μL，AMOS-（S）1 μL，AMOS-（A2）1 μL，AMOS-（IS711）2 μL，DNA 模板 3 μL，ddH2O 14 μL。

條件：95℃5min；94℃1min，60℃1.5min，72℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)，最后72℃作用10 min。

1.6 分離菌株的omp25基因測(cè)序

用已知的序列引物擴(kuò)增分離菌落的DNA，獲得omp25基因，克隆到pMD18-T載體上，送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與已知公開(kāi)的其他基因組序列用Mega軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)分析。

2 結(jié)果

2.1 Nested-PCR結(jié)果

通過(guò)Nested-PCR對(duì)樣本檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，3份樣本均檢測(cè)出布魯氏菌感染。

圖1 Nested-PCR檢測(cè)結(jié)果

2.2 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果

培養(yǎng)15 d內(nèi)，3份樣本中只有1份樣本生長(zhǎng)菌落，其余2份樣本培養(yǎng)無(wú)細(xì)菌菌落出現(xiàn)。

2.3 分離菌株AMOS-PCR結(jié)果

對(duì)分離獲得的一株細(xì)菌進(jìn)行AMOS-PCR鑒定，結(jié)果擴(kuò)增出流產(chǎn)布魯氏菌特征的擴(kuò)增條帶。

圖2 分離菌株AMOS-PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.4 分離菌株的omp25基因測(cè)序與分析

2.4.1omp25基因測(cè)序

TCTCGTAATCGTCTCGGCTGCGCTGCTGCCGTTCTCTGCGACCGCTTTTGCTGCCGACGCCATCCAGGAACAGCCTCCGGTTCCGGCTCCGGTTGAAGTAGCTCCCCAGTATAGCTGGGCTGGTGGCTATACCGGTCTTTACCTTGGCTATGGCTGGAACAAGGCCAAGACCAGCACCGTTGGCAGCATCAAGCCTGACGATTGGAAGGCTGGCGCCTTTGCTGGCTGGAACTTCCAGCAGGACCAGATCGTATACGGTGTTGAAGGTGATGCAGGTTATTCCTGGGCCAAGAAGTCCAAGGACGGCCTGGAAGTCAAGCAGGGCTTTGAAGGCTCGCTGCGTGCCCGCGTCGGCTACGACCTGAACC-CGGTTATGCCGTACCTCACGGCTGGTATTGCCGGTTCGCAGATCAAGCTTAACAACGGCTTGGACGACGAAAGCAAGTTCCGCGTGGGTTGGACGGCTGGTGCCGGTCTCGAAGCCAAGCTG

2.4.2 比較分析 系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)結(jié)果表明（圖3），分離獲得菌株的omp25基因序列與已經(jīng)公布的基因序列高度一致。

圖3 系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)

3 討論

（1）布魯氏菌病最近幾年在我國(guó)再次流行，特別是在西北地區(qū)，羊布魯氏菌流行嚴(yán)重，局部地區(qū)出現(xiàn)爆發(fā)，在當(dāng)?shù)夭剪斒暇≡谂Ｑ蛏弦才加袡z出病例。2016年，在血清學(xué)檢測(cè)基礎(chǔ)上，獲得幾份疑似布魯氏菌感染的病料樣本，為進(jìn)一步了解當(dāng)?shù)嘏２剪斒暇餍芯昙疤攸c(diǎn)，進(jìn)行細(xì)菌的分離與鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)感染牛的布魯氏菌為流產(chǎn)布魯氏菌。

（2）雖然用分子生物學(xué)方法從3份病料中均擴(kuò)增出有布魯氏菌的存在，但細(xì)菌的分離只獲得了一株布魯氏菌，分離效率低，而且分離時(shí)間長(zhǎng)；另一方面，細(xì)菌分離效率低的原因可能因流產(chǎn)布魯氏菌的分離對(duì)CO2環(huán)境的依耐型等因素引起。