劉富康，方士元，曲映紅

(上海海洋大學 食品科學與工程國家級實驗教學示范中心，上海 201306)

大青葉，為十字花科植物菘藍(Isatis indigotica Fort.)的干燥葉。菘藍的根入藥即為人們平時所俗稱的“板藍根”。大青葉味苦，性寒，具有清熱解毒、抗菌抗病毒、增強肌體免疫力等功效[1-2]。有資料顯示大青葉提取物具有一定的抑菌作用[3-4]。本文對大青葉粗黃酮提取物進行抑菌能力的研究，旨在為開發(fā)綠色安全的天然防腐劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 原料與菌種

大青葉由江西君嶺生物科技公司提供；大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、李斯特菌由本校食品學院水產(chǎn)品加工試驗室-3提供。

1.1.2 主要儀器設備

LLJ-306Z粉碎機，江門市貝爾斯頓電器有限公司；KQ5200E超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；AL204電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；DSX-280B型手提式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療儀器廠；752N紫外可見分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司；VD-650型桌上式凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司；DHP030恒溫培養(yǎng)箱，上海試驗儀器總廠；ZHWY-103B恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 粗黃酮含量的測定方法

參照王芳和LONDONO[5-6]的方法，并做些許改動。準確稱取40 mg蘆丁，用70%乙醇溶解，定容至50 mL容量瓶中。取5個25 mL比色管，分別加入0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL蘆丁溶液，各管中加入70%乙醇3.0 mL和5%亞硝酸鈉溶液0.5 mL，混勻放置6min，加10%硝酸鋁溶液0.5 mL，混勻放置6min，再加5%氫氧化鈉溶液 4.0 mL，混勻放置15min，用80%乙醇定容，以不加蘆丁標準溶液作空白對照，在波長510nm處測定吸光度。以蘆丁濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。精確稱取5 g粉碎并烘干的大青葉，70%乙醇超聲浸提，5000 r/min離心5min，將上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑后，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中用70%乙醇定容，得到大青葉粗黃酮提取液，按制作標準曲線的方法測定其吸光度，由線性回歸方程計算粗黃酮得率。

1.2.2 大青葉粗黃酮提取工藝優(yōu)化

通過單因素試驗分別考察提取溫度(50、60、70、80℃)、提取時間(30、60、90、120min)、料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25)3個因素對大青葉提取物中粗黃酮得率的影響。

在單因素試驗的基礎上，采用L9(33) 正交試驗，以大青葉提取物中粗黃酮的得率為考察指標，對提取溫度、提取時間和料液比3個影響因素進行綜合考察，進一步優(yōu)化大青葉中粗黃酮的提取工藝條件。正交試驗設計結(jié)果如表1所示。

表1 正交試驗因素水平設定Table 1 Factors and levels for orthogonal design

1.2.3 烏飯樹葉抑菌性試驗

1.2.3.1 菌種活化

配制5mL營養(yǎng)肉湯于試管中，高壓蒸汽滅菌待用。在無菌操作臺上，分別吸取50 μL大腸桿菌、李斯特菌菌種于試管中，37℃搖床培養(yǎng)24 h。

1.2.3.2 菌懸液的制備

將活化好的菌種接種到液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，采用菌落計數(shù)法制成菌數(shù)為1×108個·mL-1的菌懸液。

1.2.3.3抑菌圈試驗

分別配制50 mL營養(yǎng)瓊脂，高壓蒸汽滅菌，待冷卻到50℃時進行下一步操作。在無菌操作臺上，取已制備的菌懸液50 μL分別加入到營養(yǎng)瓊脂中，搖勻，迅速倒入無菌平板中。待營養(yǎng)瓊脂冷卻凝固以后，在平板上找三個等距的點打孔，分別加入100 μL的大青葉粗黃酮提取液，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，測定抑菌圈的直徑。

2 結(jié)果與討論

2.1 蘆丁標準曲線

經(jīng)線性回歸得出蘆丁濃度與吸光度值關系曲線的回歸方程為y=0.054x+0.0192，R2=0.9714。這表明在一定范圍內(nèi)，該方法線性關系良好，可以用來測定大青葉提取物中粗黃酮的得率。

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 提取溫度對粗黃酮得率的影響

由圖1可知，隨著提取溫度的升高，粗黃酮的得率也隨之增大。當溫度為80℃時，得率達到最大，這可能是由于隨著提取溫度不斷升高，分子運動加快，黃酮的溶解度不斷增大，且高溫易導致細胞膜破損，有利于有效成分從組織細胞轉(zhuǎn)移到提取溶劑中，增加了有效成分的溶出量[7]。

圖1 提取溫度對粗黃酮得率的影響Fig.1 Effects of extracting temperature on crude flavonoids yield

2.2.2 提取時間對粗黃酮得率的影響

圖2 提取時間對粗黃酮得率的影響Fig.2 Effects of extracting time on crude flavonoids yield

由圖2可知，隨著提取時間的增加，粗黃酮的得率也隨之提升，當提取時間達到90min時，得率達到最高，但繼續(xù)增加提取時間，粗黃酮的得率反而下降，原因可能是粗黃酮已基本溶出，而在長時間的高溫條件下可能會破壞已溶出的粗黃酮[8]，導致得率下降。

2.2.3 料液比對粗黃酮得率的影響

由圖3可以看出，隨著料液比的升高，粗黃酮的得率也隨之升高。當料液比為1∶ 25時，粗黃酮的得率達到最大。繼續(xù)增加溶劑，費用增加，且粗黃酮得率下降[9]。

圖3 料液比對粗黃酮得率的影響Fig.3 Effects of solid-liquid ratio on crude flavonoids yield

2.3 正交試驗結(jié)果

由單因素試驗得到最好的三個水平分別為提取溫度：60、70、80℃；提取時間：60、90、120min；料液比：1∶15、1∶20、1∶25，按照正交試驗設計表進行正交試驗，結(jié)果如表2所示。由表2可知，最佳的提取工藝為A3B3C3，即提取溫度80℃，提取時間120min，料液比1∶ 25時大青葉提取物中粗黃酮得率最高。通過表2的極差R分析，三者對粗黃酮得率的影響度為B >C> A，即提取時間>料液比>提取溫度。

表2 L9(33) 正交試驗結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiment

驗證試驗的結(jié)果表明，在正交試驗得到的最佳提取工藝條件下重復提取三次，粗黃酮得率平均值為3.62%±0.01%，因此正交試驗的結(jié)果是準確和穩(wěn)定的。

2.4 抑菌圈試驗結(jié)果

抑菌圈試驗結(jié)果表明，大青葉提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、李斯特菌等有害細菌均有一定的抑制作用。因此，若能有效利用大青葉粗黃酮提取物，將對因大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、李斯特菌感染造成的危害有一定的防范作用。

表3 大青葉粗黃酮對供試菌的抑菌效果Table 3 The bacteriostatic effect of the crude flavonoids from Folium Isatidis

3 結(jié)論

采用正交試驗優(yōu)化大青葉中粗黃酮的提取工藝，得到最佳的提取條件為提取時間120min、提取溫度80℃、料液比1∶25，該條件下粗黃酮的最大得率為3.62%。

大青葉粗黃酮對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、李斯特菌等有害細菌均有一定的抑制作用。大青葉粗黃酮是一種良好的天然防腐劑，值得進一步開發(fā)利用。