戴寶玲，肖英平，孫鳳來，王佩佩，桂國弘，戴賢君，楊 華,*

（1.中國計(jì)量大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310018；2.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江 杭州 310021；3.杭州余杭區(qū)仁和街道農(nóng)業(yè)公共服務(wù)中心，浙江 杭州 310000）

雞肉在世界消費(fèi)市場(chǎng)上是增長速度最快的優(yōu)質(zhì)肉類，其肉質(zhì)細(xì)嫩、滋味鮮美，因其具有高蛋白質(zhì)、低脂肪、低熱量、低膽固醇等營養(yǎng)特點(diǎn)，且供應(yīng)充足、物美價(jià)廉，現(xiàn)已經(jīng)成為世界上最受歡迎的主要肉類食品[1]。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和生活水平的提高，人們的消費(fèi)觀念也發(fā)生變化，開始越來越注重飲食的衛(wèi)生。為了保障公共衛(wèi)生安全，我國已經(jīng)相繼在各個(gè)城市的主城區(qū)全面限制活禽交易，主張家禽“集中屠宰，冷鮮上市”[2]。但有些屠宰場(chǎng)條件差，空氣不流通，屠宰環(huán)境中可能存在不同種類微生物；而雞肉食品營養(yǎng)豐富，是微生物生長的良好載體，其在屠宰和加工過程中的污染很難避免，如果控制不好將導(dǎo)致產(chǎn)品變質(zhì)，影響產(chǎn)品貨架期，甚至引起食源性疾病的發(fā)生[3-4]。目前對(duì)雞肉加工和運(yùn)輸銷售過程中微生物污染的研究較多，如屠宰加工過程中產(chǎn)生的交叉污染[5]。朱國良等[6]2014年調(diào)查了寧波市場(chǎng)生雞肉微生物污染情況，發(fā)現(xiàn)有沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌等污染。這些研究主要集中于屠宰各環(huán)節(jié)和銷售中雞肉微生物和特定食源性致病菌，對(duì)于屠宰場(chǎng)各屠宰區(qū)域中空氣微生物研究較少；然而空氣中的沉降微生物對(duì)雞肉表面污染和屠宰場(chǎng)工作人員的健康有重要影響，因此對(duì)家禽定點(diǎn)屠宰場(chǎng)的空氣微生物結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行研究具有重要意義，可以為雞肉食用安全提供有利依據(jù)。傳統(tǒng)的基于分子生物學(xué)研究微生物的方法主要有熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）、熒光原位雜交、變性梯度凝膠電泳、克隆文庫分析等[7-8]，這些方法只能檢測(cè)到部分微生物或者特定病原微生物，在種類和數(shù)量上有很大的局限性[9]。而近年來，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的迅速發(fā)展，其在分析微生物群落結(jié)構(gòu)時(shí)，有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，已成為微生物群落研究中非常重要的工具[10]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

平板計(jì)數(shù)瓊脂（plate count agar，PCA）培養(yǎng)基杭州微生物試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；離心機(jī)生工生物工程（上海）股份有限公司；PCR擴(kuò)增儀 德國Biometra公司；HiSeq測(cè)序儀 美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

在浙江某家禽定點(diǎn)屠宰場(chǎng)不同的屠宰區(qū)域，包括掛禽間、宰殺瀝血間、浸燙間、脫毛間、凈膛間（包括凈膛和清洗），分別收集屠宰前和連續(xù)屠宰5 h后空氣微生物，具體方法為：把PCA平板均勻放在各區(qū)域四角和中間位置共5 個(gè)點(diǎn)，置于距地面1 m的高度，在同一時(shí)刻將5 個(gè)點(diǎn)的平板打開暴露5 min，隨即加蓋，置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)48 h，取出計(jì)數(shù)取平均值。屠宰前平板編號(hào)為掛禽間（BH）、宰殺瀝血間（BSI）、浸燙間（BSC）、脫毛間（BD）、凈膛間（BE）；屠宰后平板編號(hào)為掛禽間（AH）、宰殺瀝血間（ASI）、浸燙間（ASC）、脫毛間（AD）、凈膛間（AE）。

1.3.2 DNA提取及擴(kuò)增

采用ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrep?試劑盒進(jìn)行空氣平板微生物DNA提取。具體為：在無菌條件下，將500 μL無菌生理鹽水加入各PCA平板中，刮取平板中所有菌苔置于滅菌離心管中，各區(qū)域的5 塊平板樣品混合后離心，去除上清液，將沉淀重懸在200 μL無菌生理鹽水中，加入ZR BashingBead Lysis Tube，后續(xù)按照試劑盒說明書提取DNA，瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)一步檢測(cè)。

以提取的D N A為模板，引物為3 3 8 F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’），對(duì)屠宰場(chǎng)環(huán)境的細(xì)菌16S rRNA基因V3～V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.3.3 測(cè)序和質(zhì)量控制

應(yīng)用Illumina HiSeq測(cè)序儀高通量技術(shù)對(duì)屠宰場(chǎng)空氣的細(xì)菌16S rRNA基因的V3～V4區(qū)進(jìn)行測(cè)序。

1.3.4 生物信息學(xué)分析

采用高通量技術(shù)對(duì)家禽屠宰場(chǎng)空氣中的細(xì)菌16S rRNA基因的V3～V4區(qū)進(jìn)行測(cè)序，QIIME 1.7.0軟件（http://qiime.org/scripts/split_libraries_fastq.html）對(duì)獲得的序列進(jìn)行篩選，得到高質(zhì)量的DNA序列[11-12]。根據(jù)測(cè)序及計(jì)算的結(jié)果和聚類分析，得到一系列樣品序列概況值（序列數(shù)量、物種數(shù)量、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、豐度指數(shù)和覆蓋度指數(shù)），并繪制稀釋性曲線、菌群結(jié)構(gòu)柱狀圖、菌群豐度熱點(diǎn)圖、菌群結(jié)構(gòu)的主坐標(biāo)分析圖等，從而反映屠宰場(chǎng)在屠宰前和屠宰后各個(gè)屠宰區(qū)域空氣微生物的多樣性及其豐富度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

將屠宰場(chǎng)各個(gè)屠宰區(qū)域在屠宰前后空氣沉降的菌落總數(shù)的平均值轉(zhuǎn)化為CFU/皿，用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA）來比較不同屠宰區(qū)域屠宰前后細(xì)菌數(shù)量或相對(duì)豐度的差異，對(duì)有顯著性差異的處理進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 屠宰場(chǎng)空氣沉降微生物數(shù)量

圖1 家禽屠宰場(chǎng)空氣菌落總數(shù)Fig.1 Total airborne bacterial counts in different areas of the poultry slaughterhouse

如圖1所示，屠宰前和屠宰后不同屠宰區(qū)域的空氣沉降微生物數(shù)量有一定的差異，特別是在掛禽間屠宰后空氣沉降菌落總數(shù)比屠宰前高出71%，可能是因?yàn)橥涝字?，掛禽間活雞多、密度大，通風(fēng)換氣差；還有糞便干燥后隨著雞跳動(dòng)會(huì)飄到空氣中，破壞了環(huán)境，也利于一些病原菌的生長；另外病原菌易于附著在雞咳嗽、鳴叫噴出來的小液滴上而進(jìn)一步擴(kuò)散傳染[13]。各個(gè)區(qū)域屠宰后菌落數(shù)都增加，只有浸燙間屠宰后菌落總數(shù)反而比屠宰前減少了60%，可能是因?yàn)榻C間溫度高，燙毛水造成的水霧使空氣不流通，空氣中的微生物不易沉降。劉秀萍等[14]調(diào)查生豬屠宰前后的環(huán)境微生物，也檢測(cè)出一定數(shù)量的菌落。趙慧等[15]分析了屠宰場(chǎng)車間空氣微生物，認(rèn)為這是肉制品污染的原因之一。

2.2 屠宰場(chǎng)空氣沉降微生物物種豐度及多樣性

通過對(duì)家禽定點(diǎn)屠宰場(chǎng)在屠宰前和屠宰后空氣微生物提取的DNA質(zhì)控、篩選等處理，最終獲得159 658 條有效序列，屠宰前5 個(gè)屠宰區(qū)域采集樣品平均獲得19 075 條，屠宰后平均是12 856 條，兩組有顯著性差異（P＝0.035）。根據(jù)聚類分析，所得測(cè)序結(jié)果如表1所示，各樣品最終獲得152～190 個(gè)操作分類單元（operational taxonomic units，OTU），在屠宰前后樣品分別平均獲得178 個(gè)和174 個(gè)OTU，兩組無顯著差異（P＝0.968），各樣品的覆蓋度指數(shù)均為1，稀釋曲線均趨于平緩（圖2），說明測(cè)序的結(jié)果合理，幾乎覆蓋了屠宰場(chǎng)空氣中的所有物種，能夠反映樣品真實(shí)多樣性組成。進(jìn)一步根據(jù)得到的OTU信息，用ChaoI指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)及Simpson指數(shù)來評(píng)估樣品微生物物種的豐富度和多樣性（表1）。

圖2 各樣品稀釋曲線Fig.2 Rarefaction curves showing bacterial community diversity

表1 樣品測(cè)序概況Table1 Summary of sequencing results for all samples

2.3 空氣沉降微生物結(jié)構(gòu)

從微生物分類門的水平可知（圖3A），從家禽定點(diǎn)屠宰場(chǎng)5 個(gè)區(qū)域在屠宰前和屠宰后各收集的沉降空氣微生物中，主要包含厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）等。其中厚壁菌門、變形菌門和放線菌門是屠宰場(chǎng)空氣微生物的優(yōu)勢(shì)菌門，分別共占每個(gè)屠宰區(qū)域每次采樣空氣微生物的84%以上，其平均相對(duì)豐度分別為45.41%（22.01%～63.28%）、34.82%（11.39%～48.84%）、12.19%（3.91%～29.60%），Kim等[16]研究屠宰過程中雞肉胴體微生物時(shí)，也檢出這3 種為優(yōu)勢(shì)菌門。Kristiansen等[17]在研究豬舍空氣微生物時(shí)發(fā)現(xiàn)厚壁菌門、變形菌門和擬桿菌門為主要的微生物。屠宰前和屠宰后沉降菌種類大致相似，但屠宰區(qū)域之間或每個(gè)區(qū)域屠宰前后空氣微生物的相對(duì)豐度有差異，其中掛禽間和宰殺瀝血間的厚壁菌門在屠宰前的相對(duì)豐度都較高，而屠宰后分別減少了21.55%和33.80%。

圖3 家禽屠宰場(chǎng)不同區(qū)域空氣菌群結(jié)構(gòu)Fig.3 Structure of airborne bacterial communities from different areas of the poultry slaughterhouse

圖4 家禽屠宰場(chǎng)不同區(qū)域菌群豐度熱點(diǎn)圖（屬水平）Fig.4 Abundance of bacteria in different areas of the poultry slaughterhouse at the genus level

從屬的水平上分析（圖3B），屠宰場(chǎng)空氣微生物種類較豐富，微生物的相對(duì)豐度幾乎都在70%以上。優(yōu)勢(shì)菌屬主要為葡萄球菌屬（Staphylococcus）和不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter），其相對(duì)豐度分別為36.90%（19.46%～53.46%）和13%（4.68%～23.41%），有研究表明，肉雞在進(jìn)入屠宰鏈時(shí)，它的羽毛、皮膚和糞便等都攜帶有大量的天然微生物，這些微生物會(huì)擴(kuò)散到空氣中，在后續(xù)的屠宰過程中可能會(huì)以不同的方式導(dǎo)致肉雞的污染[18]。

表2 家禽屠宰場(chǎng)不同區(qū)域條件致病菌相對(duì)豐度Table2 Relative abundance of conditional pathogens in different areas of the poultry slaughterhouse%

從微生物分類屬的水平上進(jìn)一步分析，菌群豐度熱點(diǎn)圖（圖4）展示出，不管是在屠宰前還是屠宰后，各個(gè)屠宰區(qū)域空氣中的葡萄球菌屬（Staphylococcus）污染較嚴(yán)重，相對(duì)豐度均超過16%（表2），葡萄球菌屬是常見的革蘭氏陽性菌，廣泛存在于自然界，也是人體皮膚、黏膜的寄殖菌，可引起人和動(dòng)物局部的化膿性感染，也可引發(fā)膿毒血癥、心內(nèi)膜炎、腦膜炎等嚴(yán)重感染[19]。還檢測(cè)出屠宰場(chǎng)空氣中有不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）和埃希菌屬（Escherichia），均具有一定的致病性，屬于條件致病菌。其中不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌平均相對(duì)豐度為13%（4.68%～23.41%）（表2），其主要分布于外部潮濕的環(huán)境中，營養(yǎng)要求低，易生長，黏附力極強(qiáng)，在臨床上發(fā)生率大于70%[20]，并且院內(nèi)感染發(fā)病率依舊不斷升高。寡養(yǎng)單胞菌屬相對(duì)豐度變化范圍為0.62%～12.38%，它是革蘭氏陰性菌，是院內(nèi)感染的重要菌種[21]，該菌主要引起肺部呼吸道感染[22]，是癌癥患者體內(nèi)重要的病原體，特別是那些有阻塞性肺癌的[23]，據(jù)研究統(tǒng)計(jì)被此菌感染后患有菌血癥的病人死亡率為14%～69%[24-25]。大多數(shù)埃希菌屬是人和動(dòng)物腸道中的正常菌群，但逐漸也發(fā)現(xiàn)自然界中存在一些致病性的埃希菌屬，主要由正常菌群條件致病，以泌尿系統(tǒng)感染常見[26]，也易引起呼吸道感染[27]。尤其是在屠宰場(chǎng)的脫毛間空氣微生物存在以上4 種條件致病菌較多，可能是因?yàn)槊撁g空氣潮濕，利于病原菌增殖，或者是由于脫毛機(jī)揚(yáng)起的羽毛、灰塵等使得空中微生物增多。

2.4 空氣沉積微生物樣品的主坐標(biāo)分析

圖5 各樣品細(xì)菌菌落結(jié)構(gòu)的主坐標(biāo)分析Fig.5 Principal coordinate analysis (PCoA) of the dissimilarity between airborne bacterial samples

根據(jù)各個(gè)樣品OTU計(jì)算樣品間的加權(quán)UniFrac距離，再對(duì)10 個(gè)樣品進(jìn)行主坐標(biāo)分析。如圖5所示，可以看出PCo1和PCo2分別解釋63.67%和20.77%差異性。各處理樣可以分為3 個(gè)集合，其中BH、BSI、BSC、ASC和AD聚集在一起，BD、ASI和AH相聚較近，BE和AE屬同一屠宰區(qū)域（凈膛間），空氣微生物種類及豐富度相近。

3 結(jié) 論

空氣中的微生物逐漸成為禽類肉制品的污染源[28]，但對(duì)家禽屠宰場(chǎng)空氣微生物結(jié)構(gòu)研究還鮮有報(bào)道，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)家禽屠宰場(chǎng)的不同屠宰區(qū)域沉降菌數(shù)量存在一定的差異，并且屠宰生產(chǎn)后比屠宰前微生物數(shù)量有所增加，尤其是在屠宰后掛禽間菌落總數(shù)比屠宰前高出71%。采用高通量測(cè)序技術(shù)分析家禽定點(diǎn)屠宰場(chǎng)不同屠宰區(qū)域空氣的微生物結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，厚壁菌門、變形菌門和放線菌門為空氣沉降微生物的優(yōu)勢(shì)菌門，葡萄球菌屬和不動(dòng)細(xì)菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)存在一定量的葡萄球菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬和埃希菌屬，這些屬的細(xì)菌均為條件性致病菌。在后續(xù)雞肉的屠宰與加工過程中，雞肉存在安全隱患，由此說明有關(guān)食品安全部門應(yīng)制定有效的干預(yù)措施，對(duì)家禽在加工過程中確保微生物安全是很重要的[29-30]，本實(shí)驗(yàn)對(duì)家禽屠宰場(chǎng)空氣微生物的檢查，為雞肉微生物污染的溯源和營造一個(gè)規(guī)范的屠宰環(huán)境提供了科學(xué)依據(jù)。