白 云，莊昕波，孫 健，徐幸蓮，周光宏,*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210095；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

加工肉制品由于具有營(yíng)養(yǎng)美味、食用方便等特點(diǎn)深受消費(fèi)者喜愛(ài)，其富含蛋白質(zhì)和微量元素。但是，加工肉制品同樣含有大量的飽和脂肪酸和膽固醇。以乳化腸為例，其含有高達(dá)30%的動(dòng)物脂肪。過(guò)多的脂肪攝入會(huì)導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生，例如肥胖、高血壓、心血管疾病和冠心病等[1]。因此，降低脂肪含量是當(dāng)前肉制品加工行業(yè)急需解決的問(wèn)題之一。在肉制品加工過(guò)程中，水分占據(jù)了舉足輕重的地位，水分子的存在形式和分布狀態(tài)決定了乳化腸的保水性、出品率及貨架期等。乳化腸中加入脂肪的作用就是提高其多汁性和保水性，使其蒸煮之后不會(huì)過(guò)分收縮，從而具有光滑、細(xì)膩的口感[2]。目前國(guó)內(nèi)外研究普遍采用脂肪替代的手段來(lái)降低脂肪含量，而消費(fèi)者追求肉制品營(yíng)養(yǎng)天然的需求則對(duì)打破常規(guī)脂肪替代法來(lái)實(shí)現(xiàn)降脂提出了要求[3-4]。然而，不采用脂肪替代，單一調(diào)整脂肪和水的比例來(lái)降低產(chǎn)品中的脂肪含量會(huì)導(dǎo)致最終產(chǎn)品保水性差，出水出油現(xiàn)象嚴(yán)重，影響消費(fèi)者對(duì)產(chǎn)品的接受程度。

超高壓技術(shù)（high pressure processing，HPP）是一種新型非熱殺菌技術(shù)，其因具有殺菌、滅酶、延長(zhǎng)貨架期及改善產(chǎn)品質(zhì)構(gòu)等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用在多個(gè)研究領(lǐng)域[5]。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道超高壓技術(shù)可以降低肉制品中的鹽含量[6-10]。但是關(guān)于利用超高壓技術(shù)改善低脂乳化腸的保水性和凝膠結(jié)構(gòu)的研究還比較少。

本研究通過(guò)測(cè)定不同壓強(qiáng)（0.1、100、200、300 MPa）處理后低脂乳化腸的保水性、低場(chǎng)核磁和微觀結(jié)構(gòu)，以研究超高壓技術(shù)能否改善低脂乳化腸保水性以及超高壓技術(shù)對(duì)蛋白凝膠結(jié)構(gòu)的影響和凝膠結(jié)構(gòu)與水分分布的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)原料選用優(yōu)質(zhì)豬背最長(zhǎng)肌及豬背膘，輔料如食鹽、糖、三聚磷酸鈉、白胡椒粉等均購(gòu)于南京市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SIM-F124制冰機(jī) 日本三洋公司；TE412-L電子天平 德國(guó)賽多利斯公司；UMC-5C斬拌機(jī) 德國(guó)Stephan公司；S-IL-100-850-9-W高壓設(shè)備 英國(guó)Stansted公司；TA-XT Plus物性測(cè)試儀 英國(guó)Stable Micro Systems公司；DC-800真空包裝機(jī) 美國(guó)希悅爾公司；TW20通用水浴槽 德國(guó)Julabo公司；PQ001型核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）成像分析儀上海紐邁電子科技有限公司；S-3000N掃描電子顯微鏡日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

將背最長(zhǎng)肌用篩孔直徑為0.8 cm的絞肉機(jī)絞碎后真空包裝，分別于100、200、300 MPa處理9 min，0.1 MPa（大氣壓強(qiáng)）處理為對(duì)照組，溫度保持在10 ℃。

1.3.2 肉糜制作

參照Lin Kuowei等[11]的方法，并稍加改動(dòng)。以瘦肉50.0 g、肥膘20.0 g計(jì)，其他添加物配比為冰水30.0 g、食鹽1.5 g、糖0.5 g、三聚磷酸鈉0.2 g、白胡椒粉0.3 g。先將肥膘用直徑0.8 cm篩孔的絞肉機(jī)絞碎，然后將處理組及對(duì)照組瘦肉分別放入斬拌機(jī)，1 500 r/min斬拌30 s，斬拌過(guò)程中加入食鹽、三聚磷酸鈉和1/3體積冰水，停3 min；再1 500 r/min斬拌30 s，斬拌過(guò)程中加入其他輔料、豬背膘和1/3體積冰水，停3 min；最后3 000 r/min斬拌60 s，斬拌過(guò)程中加入1/3體積冰水，使中心溫度低于10 ℃。

1.3.3 乳化腸制作

將25.0 g肉糜放入50 mL離心管中，80 ℃水浴加熱20 min，之后4 ℃冷藏。

1.3.4 保水性的測(cè)定

參照Kang Zhuangli等[12]的方法，并稍加改動(dòng)。稱取25.0 g生肉糜至50 mL離心管中，500×g離心15 min以去除肉糜中的氣泡。之后將離心管放入80 ℃水浴中加熱20 min。取出后將離心管倒置放于干燥皿（提前稱質(zhì)量m1）中，在室溫下放置50 min后，稱取干燥皿的質(zhì)量m2。保水性按式（1）計(jì)算。

1.3.5 NMR橫向弛豫時(shí)間（T2）的測(cè)定

將乳化腸置于室溫（25 ℃）平衡30 min后，直接切取2.0 g（勿切碎）放入直徑15 mm的核磁管中進(jìn)行測(cè)試。采用低場(chǎng)NMR弛豫CPMG序列測(cè)試，具體條件參照文獻(xiàn)[13]：溫度32 ℃，磁場(chǎng)強(qiáng)度0.5 T，共振頻率22 MHz，開(kāi)始采樣時(shí)間的控制參數(shù)為80 μs，重復(fù)采樣16 次，半回波時(shí)間250 μs，重復(fù)間隔時(shí)間6 s，得到回波13 000 個(gè)。獲得的數(shù)據(jù)采用MultiExp Inv Analysis軟件進(jìn)行反演[14]，得到T2。反演數(shù)學(xué)模型如式（2）所示。

式中：A（t）為衰減到時(shí)間t/ms時(shí)的振幅；A0i為第i個(gè)組分平衡時(shí)的振幅；T2i為第i個(gè)組分的自旋-自旋弛豫時(shí)間/ms。

1.3.6 微觀結(jié)構(gòu)觀察

參照Feng Xianchao[15]和Bian Guangliang[16]等的方法，并稍加改動(dòng)。使用掃描電子顯微鏡進(jìn)行樣品微觀結(jié)構(gòu)的觀察，制樣方法為：將乳化腸切塊（約3 cm3）后放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛溶液中固定24 h，之后切成1 cm3小塊，經(jīng)過(guò)漂洗（0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.2）、固定（質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%四氧化鋨）、漂洗、脫水（乙醇）、冷凍干燥、噴金，用掃描電子顯微鏡拍照。

利用Image J軟件對(duì)掃描電子顯微鏡圖片進(jìn)行二維化處理，一般在凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)體系中形成的孔徑小于1 μm，而圖形統(tǒng)計(jì)分析時(shí)的單位為pixel，因此根據(jù)圖片中的比例尺和軟件統(tǒng)計(jì)分析單位（pixel）按比例換算，得出對(duì)應(yīng)直徑小于1 μm孔穴中對(duì)應(yīng)于統(tǒng)計(jì)單位pixel的面積，從而進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)4 次，應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行分析，先進(jìn)行一般描述性統(tǒng)計(jì)，再進(jìn)行方差分析（用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較），以P＜0.05表示差異顯著。用Rstudio 3.5.0軟件中FactoMiner分析包進(jìn)行主成分分析[17]，并使用Factoextr分析包進(jìn)行主成分分析結(jié)果的可視化處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同壓強(qiáng)處理對(duì)低脂乳化腸保水性的影響

圖1 不同壓強(qiáng)對(duì)低脂乳化腸保水性的影響Fig.1 Changes in water-holding capacity of low-fat emulsion sausages subjected to HPP treatments

如圖1所示，乳化腸的保水性隨著壓力的變化呈顯著差異（P＜0.05）。和對(duì)照組相比，經(jīng)過(guò)高壓處理的低脂乳化腸保水性隨著壓強(qiáng)的升高而顯著增大；當(dāng)作用壓強(qiáng)增加到200 MPa時(shí)，乳化腸的保水性提高至最高值96.51%；但是當(dāng)作用壓強(qiáng)超過(guò)200 MPa達(dá)到300 MPa時(shí)，乳化腸的保水性反而下降，與對(duì)照組差異不顯著，達(dá)到90.18%。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示200 MPa的作用壓強(qiáng)是改善低脂乳化腸保水性的最大壓強(qiáng)。

本研究結(jié)果與馬亞萍等[18]的結(jié)果基本一致，其發(fā)現(xiàn)添加了卡拉膠的雞胸肉肉糜經(jīng)高壓處理后，其蒸煮損失率及水分損失率隨著壓強(qiáng)升高而減小，在200～400 MPa處理時(shí)達(dá)最低值后，又隨著壓強(qiáng)升高逐漸增加。Yang Huijuan等[19]的研究同樣發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)200 MPa高壓處理2 min，乳化腸的保水性和多汁性得到顯著的改善。這可能是因?yàn)楦邏禾幚砜梢蕴岣呒≡w維蛋白的溶解性，在后續(xù)的加熱過(guò)程中，有更多的肌原纖維蛋白疏水基團(tuán)暴露出來(lái)，發(fā)生疏水交聯(lián)，形成更加穩(wěn)定的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而提高了乳化腸最終的保水性[20]。但是當(dāng)作用壓強(qiáng)超過(guò)200 MPa時(shí)，乳化腸的保水性下降，其原因可能是在300 MPa處理時(shí)，高壓作用導(dǎo)致肌球蛋白分子聚集，其結(jié)構(gòu)過(guò)度變性，進(jìn)而在加熱過(guò)程中抑制了凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成，使其保水性下降[21]。

2.2 不同壓強(qiáng)處理對(duì)低脂乳化腸弛豫特性的影響

圖2 低脂乳化腸的低場(chǎng)NMR橫向弛豫時(shí)間T2Fig.2 T2 relaxation times of water states in low-fat emulsion sausages

肌原纖維蛋白凝膠中的水分主要包括自由水、不易流動(dòng)水和結(jié)合水3 種形態(tài)[22]。自由水代表凝膠中能夠自由流動(dòng)、存在于凝膠表面的水，通常是指熱誘導(dǎo)凝膠過(guò)程中流失的水分；不易流動(dòng)水是束縛于肌原纖維蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中的水分，約占總水分的80%；結(jié)合水是指與大分子緊密結(jié)合的一部分水分子[23]。橫向弛豫時(shí)間T2可以反映樣品中水分子的自由度，其弛豫時(shí)間的變化可以用于表征經(jīng)不同壓強(qiáng)預(yù)處理乳化腸中水分分布的情況，即水分分布狀態(tài)和自由移動(dòng)程度；弛豫峰面積比例可以反映各種狀態(tài)水分的相對(duì)含量，其變化情況可以表征經(jīng)不同壓強(qiáng)預(yù)處理的乳化腸中3 種分布狀態(tài)水分含量變化情況[24-25]。由圖2可知，低脂乳化腸T2呈現(xiàn)3 個(gè)峰，其對(duì)應(yīng)的橫向弛豫時(shí)間分別為：0～3（結(jié)合水，T2b）、50～100（不易流動(dòng)水，T21）、300～600 ms（自由水，T22）。

表1 不同壓強(qiáng)對(duì)低脂乳化腸橫向弛豫時(shí)間T2的影響Table1 Effect of HPP on T2 relaxation time of water from low-fat emulsion sausages

由表1可知，高壓處理對(duì)低脂乳化腸的結(jié)合水T2b無(wú)顯著影響。但是高壓處理顯著影響了乳化腸中不易流動(dòng)水T21，隨著高壓作用力的增加而呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。T21越小，說(shuō)明蛋白凝膠三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)對(duì)不易流動(dòng)水的束縛能力越強(qiáng)；反之，T21越大，束縛能力越差。因此，高壓處理會(huì)導(dǎo)致凝膠結(jié)構(gòu)中不易流動(dòng)水的束縛能力顯著變差，尤其在200 MPa處理時(shí)，T21最大，為85.67 ms。楊慧娟等[26]在研究通過(guò)高壓處理改善低脂低鹽乳化腸的品質(zhì)時(shí)發(fā)現(xiàn)了同樣的現(xiàn)象。此外，低脂乳化腸中自由水T22受高壓作用影響較小，呈不規(guī)則變化，這可能與自由水不受到外界束縛有關(guān)。

表2 不同壓強(qiáng)對(duì)低脂乳化腸的橫向弛豫峰面積比例的影響Table2 Effect of HPP on peak area fraction of water from low-fat emulsion sausages

由表2可知，與對(duì)照組相比，不同高壓處理顯著影響了結(jié)合水和不易流動(dòng)水的橫向弛豫峰面積比例（P＜0.05）。隨著壓強(qiáng)的升高，乳化腸中結(jié)合水的峰面積比例（P2b）顯著提高，說(shuō)明在高壓作用下肌原纖維蛋白基團(tuán)會(huì)和水分子發(fā)生水合作用。不易流動(dòng)水的峰面積比例（P21）在200 MPa處理時(shí)達(dá)到最大值，說(shuō)明經(jīng)該高壓條件處理的乳化腸能夠束縛最大量的不易流動(dòng)水。自由水的峰面積比例（P22）在0.1～200 MPa范圍內(nèi)隨著壓強(qiáng)的增加顯著下降（P＜0.05），從對(duì)照組的10.71%下降到200 MPa處理組的3.99%。由此可知，高壓處理會(huì)顯著影響水分分布情況，隨著壓強(qiáng)的增加，自由水相對(duì)含量降低，而結(jié)合水和不易流動(dòng)水的相對(duì)含量升高，說(shuō)明超高壓處理能使乳化腸中的自由水向結(jié)合水和不易流動(dòng)水轉(zhuǎn)化。

2.3 不同壓強(qiáng)處理對(duì)低脂乳化腸微觀結(jié)構(gòu)的影響

圖3 超高壓作用對(duì)低脂乳化腸顯微結(jié)構(gòu)的影響（×2 000）Fig.3 Changes in microstructure of low-fat emulsion sausages subjected to HPP treatments (× 2 000)

由圖3可知，高壓處理顯著影響蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。對(duì)照組凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)致密，但是其中存在水壑，將凝膠整體分割呈片狀或區(qū)域化。經(jīng)過(guò)高壓處理后，凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)變得多孔疏松，呈海綿狀結(jié)構(gòu)，存在大量的水穴。尤其是200 MPa處理組的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中孔狀海綿結(jié)構(gòu)最多、最大，可以束縛大量的水分，因此200 MPa處理組低脂香腸具有最好的保水性。當(dāng)處理壓強(qiáng)增加到300 MPa時(shí)，凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)重新變得致密、緊湊，孔狀結(jié)構(gòu)變小，數(shù)量減少，但是結(jié)構(gòu)整體沒(méi)有像對(duì)照組一樣呈片狀化。為了更好地對(duì)蛋白凝膠微觀變化差異進(jìn)行量化和客觀分析，利用Image J軟件對(duì)掃描電子顯微鏡圖片進(jìn)行二維化處理，測(cè)量凝膠結(jié)構(gòu)中孔隙的大小和數(shù)量[27]。由表3可知，2 0 0 M P a處理組的孔徑和數(shù)量分別是484.2 pixel2和399 個(gè)，顯著大于對(duì)照組的孔徑和數(shù)量（342.7 pixel2和177 個(gè)）。因此，高壓處理可以改善蛋白凝膠中孔狀海綿結(jié)構(gòu)，使孔變大、增多，以便束縛更多的水分于其孔隙中，這一現(xiàn)象在200 MPa處理時(shí)尤為明顯。陸海霞等[28]同樣發(fā)現(xiàn)在合適的壓強(qiáng)處理?xiàng)l件（300、400 MPa）下，肌原纖維蛋白凝膠可以形成均勻的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，但當(dāng)壓強(qiáng)繼續(xù)增大時(shí)，凝膠中出現(xiàn)了大的凝結(jié)塊。其作用壓強(qiáng)比本研究大，可能是由于他們的研究中肌原纖維蛋白凝膠未經(jīng)加熱處理，僅使用超高壓成膠。

表3 不同壓強(qiáng)對(duì)低脂乳化腸的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)孔徑和數(shù)量的影響Table3 Effect of HPP on particle size and number of cavities in microstructure of low-fat emulsion sausages

2.4 低脂乳化腸保水性、水分分布和微觀結(jié)構(gòu)主成分分析

蛋白凝膠的微觀結(jié)構(gòu)直接影響其最終的理化特性，例如保水性和凝膠強(qiáng)度等。缺少對(duì)凝膠微觀結(jié)構(gòu)的量化分析將無(wú)法客觀分析微觀結(jié)構(gòu)和理化特性的相關(guān)性。本研究通過(guò)測(cè)定水分孔隙大小和數(shù)量來(lái)間接反映凝膠的微觀結(jié)構(gòu)，為分析微觀結(jié)構(gòu)和理化特性的相關(guān)性提供了可能。同時(shí)，利用主成分分析軟件評(píng)估保水性、弛豫特性和微觀結(jié)構(gòu)之間的相關(guān)性。圖4、5是主成分分析的結(jié)果，第1主成分貢獻(xiàn)率為66.96%，第1主成分和第2主成分的總貢獻(xiàn)率為82.83%，說(shuō)明保水性、弛豫特性和微觀結(jié)構(gòu)之間存在很強(qiáng)的相關(guān)性。從載荷圖中可以發(fā)現(xiàn)：孔徑、數(shù)量、總面積、保水性、P21、T21與第1主成分呈正相關(guān)，P22與其呈負(fù)相關(guān)；第2主成分中T22和P2b與其呈正相關(guān)。從散點(diǎn)圖中發(fā)現(xiàn)，4 個(gè)處理組呈現(xiàn)離散狀態(tài)，彼此之間沒(méi)有重合。這說(shuō)明超高壓處理顯著影響了最終乳化腸的保水性、水分分布狀態(tài)和微觀結(jié)構(gòu)。而從第1主成分（微觀結(jié)構(gòu)和保水性）分析可知，4 個(gè)處理組主要分成3 類：200 MPa處理組、100 MPa處理組與0.1、300 MPa處理組。說(shuō)明0.01 MPa處理組和300 MPa處理組的微觀結(jié)構(gòu)和保水性相似，而200 MPa處理組和100 MPa處理組的微觀結(jié)構(gòu)和保水性發(fā)生了明顯變化。發(fā)生以上現(xiàn)象的原因可能是超高壓處理使得低脂乳化腸凝膠結(jié)構(gòu)中孔徑和數(shù)量顯著增加，從而提高了低脂乳化腸的保水性，但是孔隙結(jié)構(gòu)的增加也導(dǎo)致凝膠結(jié)構(gòu)對(duì)水分束縛能力的下降（T21增加）。超高壓處理提高低脂乳化腸持水能力的最佳壓力為200 MPa，其提高低脂乳化腸保水性的原因是：一方面，超高壓能促使水分子和蛋白質(zhì)基團(tuán)發(fā)生聚合作用，讓不易流動(dòng)水填補(bǔ)到蛋白質(zhì)氨基酸側(cè)鏈周圍而變成結(jié)合水，同時(shí)蛋白質(zhì)大分子鏈在高壓作用過(guò)程中發(fā)生構(gòu)象變化，也會(huì)利于極性親水基團(tuán)暴露與水分子的結(jié)合，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示超高壓處理可以顯著提高凝膠體系中結(jié)合水的比例[29]；另一方面，超高壓處理可以提高肌原纖維蛋白的溶解性，這樣在后續(xù)的加熱過(guò)程中，有更多的肌原纖維蛋白疏水基團(tuán)暴露出來(lái)，進(jìn)而發(fā)生疏水交聯(lián)。此外，文獻(xiàn)[30-31]也報(bào)道這可能是由于高壓處理可以促進(jìn)蛋白分子局部變性解聚，疏水殘基周圍形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)有利于水分子的束縛。

圖4 變量與主成分間的相關(guān)性（載荷圖）Fig.4 Correlation among variables and principal components (loading plot)

圖5 不同壓強(qiáng)處理樣品主成分評(píng)分（散點(diǎn)圖）Fig.5 Principal component score scatter plot for HPP-treated samples at different pressures (scatter plot)

3 結(jié) 論

經(jīng)超高壓處理的乳化腸體系中水分子的分布狀態(tài)發(fā)生顯著變化。隨著作用壓強(qiáng)從0.1 MPa（大氣壓強(qiáng)）增加到300 MPa（尤其在200 MPa時(shí)），乳化腸凝膠體系中結(jié)合水與肌肉蛋白的結(jié)合程度增強(qiáng)，自由水向不易流動(dòng)水和結(jié)合水轉(zhuǎn)化，提高了乳化腸的保水性。主成分分析發(fā)現(xiàn)乳化腸保水性和凝膠微觀結(jié)構(gòu)顯著相關(guān)，超高壓處理顯著影響乳化腸微觀結(jié)構(gòu)中孔徑和數(shù)量以及水分分布。