馬榕 黃如 郭帥 周政 浦金賢 趙曉俊

在中國(guó)，膀胱尿路上皮細(xì)胞癌(uroepithelium cell carcinomas of the bladder, BUCC)居男性泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤發(fā)病率第一位，全部惡性腫瘤發(fā)病率第八位，已確定的危險(xiǎn)因素包括吸煙和暴露于芳香胺、電離輻射和環(huán)磷酰胺[1]。近年來,有文獻(xiàn)報(bào)道BUCC的發(fā)病與人乳頭瘤病毒(human papilloma virus, HPV)感染有關(guān)[2]。HPV，尤其是其中的16型，已被證實(shí)在人上皮細(xì)胞腫瘤中起重要作用[3]。HPV感染直接或間接導(dǎo)致了約10%的人類腫瘤形成[4]。部分研究認(rèn)為HPV與BUCC的發(fā)生有密切關(guān)系，并影響其病理分級(jí)[5-6]；而部分研究則認(rèn)為HPV與BUCC的發(fā)生和發(fā)展無明顯相關(guān)性[7]。本研究對(duì)BUCC及對(duì)照組患者膀胱組織中HPV-16型的感染狀況進(jìn)行了檢測(cè)，旨在明確高危型HPV-16型與BUCC的關(guān)系。

對(duì)象與方法

一、組織標(biāo)本的收集

本實(shí)驗(yàn)標(biāo)本均取自2014年9月至2017年12月于我院泌尿外科就診的患者，其中實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本(70例)取自病理確診為BUCC的患者，對(duì)照組標(biāo)本(60例)取自因結(jié)石行膀胱鏡或輸尿管鏡檢查的患者。所取標(biāo)本離體后盡快裝入EP管并立即轉(zhuǎn)入-80 ℃ 冰箱內(nèi)保存。每個(gè)標(biāo)本均用福爾馬林固定，病理診斷由我院病理科醫(yī)師完成。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且患者及其家屬均知情同意。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.抽提DNA:取細(xì)胞懸液，離心后用基因組提取試劑盒提取 DNA，按試劑盒中的操作說明嚴(yán)格進(jìn)行各步驟，最后將DNA濃度統(tǒng)一稀釋成100 ng/μl，存放于-20 ℃ 的設(shè)備中。

2.PCR擴(kuò)增：使用引物核苷酸序列：HPV-16(1)，5′-AAGGCCAACTAAATGTCAC-3′；HPV-16(2)，5′-CTGCTTTTATACTAACCGG-3′，片段長(zhǎng)度為 217 bp。反應(yīng)總體積25 μl，含10×PCR緩沖液[10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.4)、50 mmol/L KCl、1.5 mmol/L MgCl2]2.5 μl、2.5 mmol/L dNTP(dATP、dCTP、dGTP和dTTP)0.5 μl、10 pmol/μl引物各0.5 μl、TaqDNA聚合酶0.15 μl(5 U/μl)以及cDNA模板100 ng，加無菌ddH2O補(bǔ)到25 μl。反應(yīng)條件：94 ℃ 預(yù)變性5 min，94 ℃ 變性30 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸1 min，30個(gè)循環(huán)后最后72 ℃延伸10 min。

3.PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳：取10 μl PCR 產(chǎn)物做1.0% 瓊脂糖凝膠電泳，以天能凝膠成像系統(tǒng)拍攝處理。

4.結(jié)果判定：若在217 bp 處出現(xiàn)明亮條帶，和預(yù)判結(jié)果相符，表明HPV-16 DNA陽(yáng)性，產(chǎn)物經(jīng)過電泳分析后進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。見圖1。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以率(%)表示，運(yùn)用卡方檢驗(yàn)和95%置信區(qū)間進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

M:D2000 Marker;1:HPV-16感染組織;2:陰性對(duì)照

圖1 電泳結(jié)果判定

結(jié) 果

對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組病例的性別及年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，實(shí)驗(yàn)組吸煙人數(shù)與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而與飲酒無顯著關(guān)聯(lián)(P>0.05)?；颊吲R床一般資料見表1。

PCR結(jié)合凝膠電泳方法檢測(cè)結(jié)果顯示，HPV-16在實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)(15.7%)和對(duì)照組中的表達(dá)(13.3%)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，并且與患者的年齡及腫瘤分化程度無關(guān)(P>0.05)。見表2。

表1 兩組患者臨床一般資料比較[n(%)]

表2 HPV-16的表達(dá)與年齡及腫瘤分化程度之間的關(guān)系[n(%)]

討 論

HPV屬乳多空病毒科DNA病毒，HPV的基因組是雙鏈閉環(huán)，目前認(rèn)為口腔乳頭狀瘤、尖銳濕疣一般是由HPV-6和HPV-11引起的[2]。口咽鱗癌和癌前病變主要是由HPV-16和HPV-18感染導(dǎo)致，在宮頸鱗癌的患者中，約有50%感染HPV-16和(或)HPV-18[8-9]。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤的HPV感染率較高，尤其是HPV-16感染[10-12]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，HPV感染與前列腺癌的發(fā)生有一定的相關(guān)性[13-15]。

關(guān)于膀胱癌與HPV的相關(guān)性，研究結(jié)論存有爭(zhēng)議，Shaker 等[16]研究顯示，BUCC高危型 HPV-16/18 陽(yáng)性率明顯高于慢性膀胱炎和正常膀胱組織，且與膀胱癌患者的臨床分期具有一定的相關(guān)性。Polesel等[17]對(duì)尿液中的HPV進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示HPV與膀胱癌無明顯相關(guān)性。Schmid等[7]對(duì)中歐人群樣本進(jìn)行了前瞻性研究，研究結(jié)果表明HPV感染與膀胱癌的發(fā)生和發(fā)展無相關(guān)性。

本研究主要應(yīng)用PCR結(jié)合凝膠電泳的方法對(duì)BUCC病例組及對(duì)照組膀胱組織中的HPV-16進(jìn)行了檢測(cè)。數(shù)據(jù)分析顯示，BUCC病例組和對(duì)照組中HPV-16的檢出率相差無幾，且檢出率都較低，因此，我們認(rèn)為HPV-16感染與BUCC無顯著相關(guān)性。并且，在BUCC病例組中，不同年齡段和不同腫瘤分化程度標(biāo)本的HPV-16感染率也無明顯差異。通過對(duì)患者生活習(xí)慣的調(diào)查，我們發(fā)現(xiàn)吸煙與BUCC患病有明顯相關(guān)性，但與飲酒無明顯關(guān)聯(lián)。

本研究使用的HPV-16檢測(cè)方法，即PCR結(jié)合凝膠電泳，是目前最敏感的檢測(cè)HPV病毒的方式之一[18]。本研究認(rèn)為，一般情況下無論是正常膀胱組織，還是BUCC患者的腫瘤組織，HPV-16的感染率均較低，BUCC的發(fā)生與HPV-16感染無關(guān)。