郭帥 趙曉俊 周政 浦金賢 江弢

全世界范圍內(nèi)，膀胱腫瘤為第五大惡性腫瘤，傳統(tǒng)的檢查方法有膀胱鏡和尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查。膀胱鏡是公認(rèn)的確診膀胱腫瘤的金標(biāo)準(zhǔn)，但其價(jià)格不低，且會(huì)給患者帶來一定的不適感[1]；尿脫落細(xì)胞學(xué)雖然可在一定程度上彌補(bǔ)膀胱鏡的不足，但其存在敏感性較差的缺陷，特別是針對(duì)低級(jí)別移行細(xì)胞癌[2-3]。

巢蛋白(nidogen， NID)家族包括NID1、NID2，是基底膜的主要構(gòu)成成分之一，基底膜在細(xì)胞的分化、增殖和遷移方面發(fā)揮著重要的作用，因此，NID基因的異常表達(dá)易造成細(xì)胞膜的不穩(wěn)定而引起病變[4-5]。同源盒(HOX)基因的編碼產(chǎn)物是一種重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在控制胚胎發(fā)育和調(diào)節(jié)細(xì)胞分化過程中發(fā)揮重要作用[6-7]。關(guān)于膀胱腫瘤與NID2和HOXA9基因的相關(guān)性，目前國(guó)外有研究顯示腫瘤患者尿液樣本中NID2和HOXA9基因甲基化水平顯著高于正常對(duì)照者[8-12]。本研究采用甲基化特異性PCR(MSP)技術(shù)對(duì)膀胱腫瘤患者尿液標(biāo)本中NID2和HOXA9基因甲基化水平進(jìn)行了檢測(cè)，以明確其在膀胱腫瘤診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

對(duì)象與方法

一、一般資料

2015年4月至2017年6月蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科收治的原發(fā)性膀胱尿路上皮癌患者70例納入研究，70例患者均為首次確診，之前未經(jīng)手術(shù)及化療等治療。70例中男48例、女22例，年齡41～81歲，中位年齡63歲。參照WHO(2004)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行腫瘤分級(jí)(低度惡性潛能-LMP、低級(jí)別-Low和高級(jí)別-High)，參照TNM(2010)進(jìn)行臨床分期。納入研究的70例患者的尿液標(biāo)本作為實(shí)驗(yàn)組，另采集60例泌尿系其他疾病患者的尿液標(biāo)本作為對(duì)照組，對(duì)照組中男35例、女25例，年齡37～73歲，中位年齡54歲(表1)。收集的尿液標(biāo)本為術(shù)前晨尿中間段(50 ml)，完成收集后立刻轉(zhuǎn)入-20 ℃冰箱保存。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過，所有受試對(duì)象均知情同意。

表1 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組一般資料

二、尿脫落細(xì)胞DNA的提取

取5 ml尿液樣本，采用通用型基因組DNA提取試劑盒(CWO 0550，康為世紀(jì))提取尿脫落細(xì)胞總DNA，提取的DNA樣本于-20 ℃冰箱保存。

三、MSP檢測(cè)

采用亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化試劑盒(EZ-DNA Methylation-Gold kit,ZYMO Research)進(jìn)行DNA的亞硫酸氫鹽修飾及純化，用亞硫酸氫鹽修飾過的T47D作為陽性質(zhì)控品，293作為陰性質(zhì)控品，ddH2O作為對(duì)照進(jìn)行PCR擴(kuò)增。甲基化特異性引物序列NID2順義鏈：5′-GTTTCGCGGTTTTTAAGGA-3′,反義鏈：5′-ACGCTAAACTCATCTCCTAC-3′,探針：5′-GTTCGTAAGGTTTGGGGTAGCG-3′;甲基化特異性引物序列HOXA9順義鏈：5′-GTTATTATCGTGTTTAGCG-3′，反義鏈：5′-CGATACCACCAAATTATTA-3′，探針：5′-GTTCGTTCGGTTCGATTTACG-3′;內(nèi)參基因ACTB順義鏈：5′-GGAGGAGGTTTAGTAAGT-3′，反義鏈：5′-CAATAAAACCTACTCCTCCC-3′，探針：5′-CACCACCCAACACACAATA-3′。甲基化反應(yīng)體系為20 μl，5 μl修飾的DNA模板，每種dNTP濃度均為0.25 mmol/L，每種引物濃度均為0.4 μmol/L，2單位Taq 聚合酶。反應(yīng)過程：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性20 s，61 ℃復(fù)性延伸40 s，共計(jì)45個(gè)循環(huán)。兩個(gè)基因有一個(gè)基因CT值<35即判定為陽性，其中內(nèi)參通道CT值>30，判讀樣本為不合格樣本。每例樣本設(shè)置3個(gè)對(duì)照：甲基化陽性、陰性對(duì)照及水作為空白對(duì)照。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料用百分比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用Fisher確切概率檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。診斷敏感性和特異性采用受試者工作曲線(ROC)進(jìn)行分析，并計(jì)算其曲線下面積(AUC)。

結(jié) 果

一、尿液標(biāo)本NID2、HOXA9甲基化水平

實(shí)驗(yàn)組尿液標(biāo)本NID2甲基化率檢測(cè)靈敏度為74%(52/70)，特異度為85%(51/60)，NID2甲基化檢測(cè)結(jié)果見圖1；HOXA9甲基化率檢測(cè)靈敏度為84%(59/70)，特異度為93%(56/60)，HOXA9甲基化檢測(cè)結(jié)果見圖2；雙指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)的靈敏度為89%(62/70)，特異度為80%(48/60)。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組基因甲基化水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，不同分期和分級(jí)腫瘤尿液樣本基因甲基化狀態(tài)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.485、0.241) (表2)。

圖1 NID2基因甲基化檢測(cè)結(jié)果(紅色為陽性，綠色為陰性)

表2 實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組尿液標(biāo)本基因甲基化檢測(cè)結(jié)果及診斷效能

圖2 HOXA9基因甲基化檢測(cè)結(jié)果(紅色為陽性，綠色為陰性)

70例膀胱腫瘤患者尿脫落細(xì)胞學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，31例為陽性或可疑，靈敏度為44%(31/70)，特異度為78%(47/60)。雙指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)的靈敏度和特異度均高于尿脫落細(xì)胞學(xué)檢測(cè)。

二、ROC及AUC

膀胱腫瘤患者尿液標(biāo)本NID2基因甲基化的AUC為0.84(0.77～0.91)，HOXA9基因甲基化的AUC為0.91(0.85～0.96)，雙指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)的AUC為0.92(0.87～0.97)。雙基因甲基化聯(lián)合檢測(cè)的ROC見圖3。

圖3 NID2和HOXA9基因甲基化聯(lián)合檢測(cè)ROC

討 論

腫瘤的發(fā)生發(fā)展與基因環(huán)境的相互作用和病因?qū)W有密切的關(guān)聯(lián)[13]，基因突變?cè)谀[瘤進(jìn)展過程中發(fā)揮重要作用，但在表觀遺傳學(xué)中，基因的甲基化未改變基因的序列，而是通過改變構(gòu)型影響基因的轉(zhuǎn)錄，繼而引起基因沉默[14]。CpG二核苷酸是最主要的甲基化位點(diǎn)，CpG通常以兩種形式存在，一種是分散于DNA中，另一種是CpG結(jié)構(gòu)高度聚集的CpG島[15]。正常組織中分散于DNA中的CpG的位點(diǎn)通常是甲基化的，而位于健康人基因啟動(dòng)子區(qū)的CpG島處于非甲基化狀態(tài)[16]，CpG島甲基化可引起相關(guān)基因的沉默，從而引起腫瘤的發(fā)生發(fā)展[17-18]。

Reinert等[11]使用基因芯片對(duì)膀胱腫瘤基因中27 000個(gè)CpG島進(jìn)行了研究，從中發(fā)現(xiàn)了多個(gè)異常甲基化的位點(diǎn)，部分有可能成為預(yù)測(cè)膀胱腫瘤的標(biāo)志物，膀胱腫瘤組織中HOXA9基因的甲基化特異性和敏感性分別達(dá)到了74%和96%。國(guó)外已有學(xué)者使用MSP技術(shù)檢測(cè)膀胱腫瘤患者尿脫落細(xì)胞NID2的甲基化狀態(tài)，取得了良好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其敏感性和特異性均高于尿脫落細(xì)胞學(xué)檢測(cè)[10，12]，但相關(guān)研究在國(guó)內(nèi)鮮有報(bào)道。

本研究分析了膀胱腫瘤患者尿液標(biāo)本中NID2和HOXA9基因甲基化表達(dá)情況。研究發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組尿液標(biāo)本中NID2和HOXA9基因的甲基化率較高，分別達(dá)到了74%和84%，對(duì)照組尿液標(biāo)本中基因甲基化率分別僅為15%和7%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但統(tǒng)計(jì)結(jié)果提示甲基化與腫瘤的分級(jí)、分期等臨床參數(shù)無顯著相關(guān)性，該結(jié)論與國(guó)內(nèi)外一些研究結(jié)果相一致[12，19]。但也有研究認(rèn)為基因甲基化與膀胱腫瘤的分級(jí)、分期等臨床參數(shù)有關(guān)，特別是在低分化膀胱腫瘤組織中更易檢出[20-21]。NID2和HOXA9基因甲基化聯(lián)合檢測(cè)的AUC值為0.92，高于任一單基因檢測(cè)，表明聯(lián)合檢測(cè)有更高的價(jià)值。

Renard等[10]于2010年首次報(bào)道了膀胱腫瘤尿液中NID2的表達(dá)情況，顯示出較高的敏感性和特異性。Reinert等[8]于2012年首次報(bào)道了HOXA9對(duì)膀胱腫瘤的診斷價(jià)值，并且認(rèn)為其在監(jiān)測(cè)膀胱腫瘤復(fù)發(fā)中具有重要作用。Scher等[22]使用巢式PCR技術(shù)檢測(cè)尿液標(biāo)本中NID2基因，發(fā)現(xiàn)NID2基因與膀胱腫瘤有密切的關(guān)聯(lián)，盡管實(shí)驗(yàn)方法不同，本研究也支持這一結(jié)論。本研究中，我們將泌尿系其他疾病的尿液標(biāo)本作為對(duì)照組，但值得注意的是有少部分對(duì)照組患者的尿液中檢測(cè)出了基因甲基化狀態(tài)，然而到目前為止，尚未有相關(guān)研究證明在這些疾病中存在NID2和HOXA9基因的甲基化，這可能是由于①尿液收集時(shí)存在污染；②存在實(shí)驗(yàn)檢測(cè)操作問題；③該疾病有可能并發(fā)膀胱腫瘤，但膀胱腫瘤未得到確診。針對(duì)這些不足之處，我們會(huì)進(jìn)一步完善后續(xù)的收集和實(shí)驗(yàn)操作以及對(duì)患者進(jìn)一步的隨訪。

綜上所述，NID2和HOXA9基因甲基化聯(lián)合檢測(cè)的診斷價(jià)值優(yōu)于單一基因，雙指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)可能成為一種有效的診斷原發(fā)性膀胱腫瘤的方法。目前在臨床診斷方面，膀胱鏡依然是金標(biāo)準(zhǔn)，尿脫落細(xì)胞學(xué)也是重要的輔助手段，尚未有足夠的證據(jù)表明尿液NID2和HOXA9基因甲基化檢測(cè)可替代尿脫落細(xì)胞學(xué)檢測(cè)，將來進(jìn)一步的前瞻性研究若能證明其可行性，這樣就可為患者提供一種舒適、無痛且方便的檢測(cè)新方法。