邢少姬 康茹雪 張 萱 王殿棟 鄭連生 張亞瓊 何 珊

(包頭醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014060)

大腸癌(CRC)在我國(guó)城市和農(nóng)村發(fā)病率分列所有惡性腫瘤的第3、5位，病死率分別居第4、5位〔1〕?，F(xiàn)已明確，遺傳和環(huán)境因素相互作用是導(dǎo)致CRC發(fā)生的主要原因，其中，環(huán)境因素是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的始動(dòng)因素，個(gè)體遺傳特征則決定腫瘤的易感性。硒蛋白(Sel)S是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及細(xì)胞膜駐留蛋白。目前研究發(fā)現(xiàn)，SelS具有廣泛的生物學(xué)功能，能清除過(guò)氧化物，保護(hù)細(xì)胞免遭氧化物損傷，抑制和調(diào)節(jié)炎癥和免疫反應(yīng)，在維持細(xì)胞DNA和蛋白質(zhì)的穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用等〔2，3〕。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外的一些研究發(fā)現(xiàn)，SelS基因多態(tài)性與胃腸道惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)〔4～7〕，但尚未見(jiàn)內(nèi)蒙古地區(qū)漢族人群的相關(guān)報(bào)道。本研究采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)檢測(cè)CRC患者的SelS基因多態(tài)性，探討內(nèi)蒙古漢族人群CRC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)與SelS基因多態(tài)性的相關(guān)性。

1 資料和方法

1.1一般資料 2015年7月至2016年10月包頭市腫瘤醫(yī)院、包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院經(jīng)組織病理學(xué)確診的新發(fā)CRC患者126例(CRC組)，男73例，女53例，年齡39～79〔平均(61.81±12.55)〕歲，均無(wú)放、化療史，無(wú)胃腸道遺傳病史。對(duì)照組來(lái)自同期社區(qū)健康體檢人群135例，男85例，女50例，年齡35～80〔平均(60.07±10.42)〕歲，經(jīng)詢問(wèn)病史、體檢和各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室檢查排除其他胃腸道遺傳病、糖尿病、冠心病及高血壓等其他疾病。入選對(duì)象均為漢族，已在內(nèi)蒙古地區(qū)居住10年以上，彼此無(wú)血緣關(guān)系。CRC組和對(duì)照組在年齡、性別上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2主要試劑和儀器 基因組DNA提取試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，引物(上海生工生物工程股份有限公司)，PCR擴(kuò)增試劑盒和100 bp DNA Ladder Marker(北京天根生化科技有限公司)，限制性內(nèi)切酶HinfI(英國(guó)NEB公司)。UV-160分光光度計(jì)(日本島津制作所)、高速離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司)，PCR儀C1000 TouchTM Thermal Cycler及凝膠成像分析系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad 公司)。

1.3基因組DNA的提取與引物合成 采集研究對(duì)象空腹靜脈血2 ml，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，試劑盒提取外周血基因組DNA，用UV-160分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度和純度，-20℃保存。SelS基因rs34713741多態(tài)位點(diǎn)引物序列參考文獻(xiàn)〔6，7〕，上游序列：5′-CTTCCGGTGCGCTCCTAC-3′，下游序列：5′-GGCGACCACTGACTTCCTT-3′，擴(kuò)增目的基因長(zhǎng)度為 302 bp。在Pubmed-SNP數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢SelS基因rs34713741位點(diǎn)兩側(cè)基因序列(NC_000015.10)的準(zhǔn)確性，并通過(guò)BLAST 軟件驗(yàn)證引物的特異性。

1.4PCR擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μl，其中含6 μl模板(約100 ng)，上、下游引物各1 μl(10 μmol/L)，12.5 μl 2×Taq PCR Master Mix，4.5 μl去離子水。PCR擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù)：預(yù)變性95℃、5 min，變性95℃、30 s，退火62℃、30 s，延伸72℃、1 min，35個(gè)循環(huán)，最后延伸72℃、5 min。

1.5基因分型及測(cè)序 酶切反應(yīng)體系為20 μl，其中包括PCR擴(kuò)增產(chǎn)物12 μl，HinfI內(nèi)切酶2.0 μl，10×限制性內(nèi)切酶緩沖液2.0 μl，去離子水4.0 μl。37℃水浴30 min后，酶切產(chǎn)物于2.5%瓊脂糖凝膠上電泳，用凝膠成像分析系統(tǒng)分析其基因型(TT型為302 bp 1個(gè)片段；CT型為302 bp、198 bp、104 bp 3個(gè)片段；CC型為198 bp、104 bp 2個(gè)片段)。為驗(yàn)證分型的準(zhǔn)確性，隨機(jī)選取50例PCR產(chǎn)物純化后送上海美吉生物北京實(shí)驗(yàn)基地測(cè)序驗(yàn)證。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、Fisher確切概率法、非條件Logistic回歸模型。

2 結(jié) 果

2.1SelS基因rs34713741多態(tài)位點(diǎn)分型及測(cè)序結(jié)果 SelS基因rs34713741位點(diǎn)存在2個(gè)等位基因C和T，組成CC、CT、TT 3種基因型(見(jiàn)圖1)。且測(cè)序結(jié)果與酶切結(jié)果完全一致(見(jiàn)圖2)。

M：100 bp DNA Ladder Marker；1、3：TT型；4、5、7：CT型；2、6：CC型圖1 SelS基因rs34713741 RFLP基因分型電泳結(jié)果

A為CC型；B為CT型；C為T(mén)T型；橫線部分為內(nèi)切酶HinfI識(shí)別位點(diǎn)，箭頭所指為SelS基因rs34713741位點(diǎn)堿基圖2 SelS基因rs34713741位點(diǎn)PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果

2.2SelS基因rs34713741位點(diǎn)多態(tài)性與CRC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系 研究人群SelS基因rs34713741位點(diǎn)頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡定律，表明所選樣本具有群體代表性(χ2=0.017，P>0.05)。CRC組和對(duì)照組CC、CT、TT基因型分布頻率、等位基因C、T分布頻率均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 兩組SelS基因rs34713741位點(diǎn)基因型、等位基因分布〔n(%)〕

2.3SelS基因rs34713741位點(diǎn)多態(tài)性與不同臨床特征的關(guān)系 遠(yuǎn)端大腸組和對(duì)照組的CC、CT、TT基因型分布頻率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，遠(yuǎn)端大腸組CC基因型分布頻率明顯低于對(duì)照組，攜帶T等位基因的CT和(或)TT個(gè)體患CRC的風(fēng)險(xiǎn)是CC基因型個(gè)體的1.719倍(OR=1.719，95%CI：1.144～2.582)。近端大腸組、高、中、低分化組中CC、CT、TT基因型分布頻率與對(duì)照組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)。提示SelS基因rs34713741位點(diǎn)多態(tài)性影響遠(yuǎn)端CRC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，但與腫瘤分化程度無(wú)關(guān)聯(lián)。見(jiàn)表2。

表2 SelS基因rs34713741位點(diǎn)多態(tài)性與不同臨床特征的關(guān)系〔n(%)〕

1)與對(duì)照組比較：P<0.05

3 討 論

硒是哺乳動(dòng)物及人體必需的微量元素之一，主要以硒代半胱氨酸的形式存在于蛋白質(zhì)中。SelS的主要生物學(xué)功能有：保護(hù)細(xì)胞免受活性氧損傷的抗氧化功能，參與炎癥反應(yīng)，參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及相關(guān)蛋白降解，參與脂蛋白代謝、精子發(fā)育等〔8，9〕。SelS的基因定位于15q26.3，包含6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子，是由1 250和1 292個(gè)堿基組成的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄變體，最終的編碼產(chǎn)物均為189個(gè)氨基酸殘基組成的SelS，其中第188位為硒代半胱氨酸殘基〔10〕。因此，一旦SelS基因發(fā)生突變，可能導(dǎo)致其編碼產(chǎn)物發(fā)生變化，進(jìn)而影響抗氧化損傷、抗炎癥反應(yīng)等正常生物學(xué)功能，降低人體細(xì)胞抵御惡性腫瘤發(fā)生的能力?？偨Y(jié)目前國(guó)內(nèi)外的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，與胃腸道惡性腫瘤密切相關(guān)的Sel基因多態(tài)性位點(diǎn)多位于基因的啟動(dòng)子區(qū)，該處基因的變異相比于編碼區(qū)對(duì)Sel表達(dá)的影響更大，更易改變個(gè)體罹患腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)〔11〕。目前已發(fā)現(xiàn)SelS基因至少存在15個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，但研究最多的是位于基因啟動(dòng)子區(qū)的rs28665122和rs34713741位點(diǎn)。如日本Shibata等〔12〕發(fā)現(xiàn)，SelS基因rs28665122位點(diǎn)多態(tài)性與日本人群胃癌的遺傳易感性具有相關(guān)性，A等位基因的個(gè)體與GG基因型的個(gè)體相比，患胃癌的風(fēng)險(xiǎn)顯著增高。Meplan等〔5〕研究發(fā)現(xiàn)捷克人群SelS基因rs34713741位點(diǎn)多態(tài)性與結(jié)直腸癌的發(fā)病具有相關(guān)性，TT基因型個(gè)體的患病風(fēng)險(xiǎn)是CC基因型個(gè)體的1.68倍。張龍等〔6〕、毛華杰等〔7〕在針對(duì)SelS基因rs34713741位點(diǎn)多態(tài)性與胃腸道癌癥遺傳易感性的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，SelS基因rs34713741位點(diǎn)多態(tài)性與CRC和胃癌的發(fā)病均有關(guān)，癌癥組CC基因型分布頻率明顯低于健康對(duì)照組，T等位基因可能是中國(guó)人群胃腸癌發(fā)病的危險(xiǎn)因素之一。

本研究提示SelS基因rs34713741位點(diǎn)多態(tài)性與CRC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)相關(guān)性，與遠(yuǎn)端CRC的發(fā)病具有相關(guān)性，T等位基因可能是內(nèi)蒙古漢族人群遠(yuǎn)端CRC發(fā)病的危險(xiǎn)因素，這與張龍等〔8〕等報(bào)道湖南漢族的結(jié)果基本一致，但同時(shí)也存在差異，湖南漢族人群SelS基因rs34713741位點(diǎn)多態(tài)性與CRC發(fā)病有關(guān)，攜帶T等位基因的個(gè)體患CRC的風(fēng)險(xiǎn)是CC基因型個(gè)體的1.597倍(OR=1.597，95%CI：1.096～2.326)，且在遠(yuǎn)側(cè)CRC組此風(fēng)險(xiǎn)增加，是CC基因型的1.617倍(OR=1.617，95%CI：1.060～2.466)。這可能與不同地區(qū)被研究人群的遺傳背景不同有關(guān)。另外，本研究由于所涉樣本例數(shù)有限，易出現(xiàn)偏倚。在后續(xù)的研究中需繼續(xù)增加樣本例數(shù)進(jìn)行分析。此外，基因間的相互作用及與環(huán)境危險(xiǎn)因素的協(xié)同作用均對(duì)腫瘤的患病風(fēng)險(xiǎn)有較大影響〔13〕。因此，還需繼續(xù)研究基因間及基因與環(huán)境間的交互作用。