巴爽，張宏艷

川崎?。↘awasaki disease，KD）是兒童時期獲得性心臟病的重要誘因，在世界范圍均有報(bào)道，其中亞裔兒童發(fā)病率最高，且呈逐年增多趨勢。多年來，各國學(xué)者對KD病因?qū)W及發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了不斷探索，發(fā)現(xiàn)KD可能并發(fā)嚴(yán)重的冠狀動脈病變（coronary artery lesions，CALs），后者包括冠狀動脈擴(kuò)張、冠狀動脈瘤、冠狀動脈重塑、冠狀動脈狹窄及閉塞、冠狀動脈瘺；其嚴(yán)重程度差別很大，輕者短期可恢復(fù)正常，重者持續(xù)異常，是KD的主要死亡原因［1-2］。經(jīng)規(guī)范應(yīng)用靜脈輸注丙種球蛋白（IVIG）治療后，仍有5%左右的KD患者發(fā)生CALs［1］。但是臨床上尚無在早期識別這些患者的可靠指標(biāo)。

多項(xiàng)研究表明，鈣釋放激活鈣調(diào)節(jié)蛋白1（ORAI1）基因單核苷酸多態(tài)性（SNPs）與炎癥性疾病的發(fā)生相關(guān)［3-4］。ORAI1基因SNP與KD相關(guān)性的研究存在不同的結(jié)論。Kuo等［5］研究表明ORAI1基因SNP與中國臺灣兒童KD發(fā)病無關(guān)。而Onouchi等［6］研究證實(shí)，該基因SNP與日本兒童KD發(fā)病有關(guān)。研究結(jié)果的差異可能與種族差異及遺傳異質(zhì)性有關(guān)。而ORAI1rs3741596 SNP與KD及并發(fā)CALs的相關(guān)性研究在國內(nèi)尚鮮見報(bào)道。本研究通過PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因，聯(lián)合基因直接測序技術(shù)檢測所有研究對象基因組DNAORAI1基因rs3741596位點(diǎn)SNP，旨在探討該基因位點(diǎn)基因型分布及等位基因頻率與KD發(fā)病及合并CALs是否存在相關(guān)性，為早期確診CALs人群和尋求新的治療方法提供可靠的分子生物學(xué)指標(biāo)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 本研究選取2016年2月—6月在天津市兒童醫(yī)院確診KD并住院治療的46例患兒納入病例組，其中男30例，女16例，年齡2個月～8歲，平均（3.39±1.77）歲。所有病例均符合KD診斷標(biāo)準(zhǔn)，所有患兒均在應(yīng)用IVIG治療前行超聲心動檢查，根據(jù)是否合并CALs［8］，將病例組分為CAL組（男15例，女5例）和NCAL組（男15例，女11例）2個亞組。收集同期天津市兒童醫(yī)院門診行健康體檢的兒童25例納入對照組，男17例，女8例，年齡6個月～7歲，平均（3.72±1.65）歲，均排除近期川崎病、感染性疾病及其他免疫系統(tǒng)疾病等病史。所有研究對象均為漢族，病例組和對照組年齡（t=1.270，P=0.206）及性別比例（χ2=0.056，P=0.813）差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，相互之間無血緣關(guān)系。本研究獲醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)并征得所有研究對象的法定監(jiān)護(hù)人同意。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 使用一次性真空采血管（EDTA抗凝）空腹采集研究對象2 mL外周靜脈血，置于-80℃冰箱保存用于提取DNA。

1.2.2 基因組DNA提取 應(yīng)用CWBIO公司生產(chǎn)的血液基因組柱式小量提取試劑盒（Blood Genomic DNA mini kit）提取基因組DNA，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，所得DNA樣本置于-20℃冰箱保存。

1.2.3 PCR擴(kuò)增、測序和分析 本實(shí)驗(yàn)根據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center For Biotechnology Information，NCBI）（http://www.ncbi.nlm.nlh.gov）公布的ORAI1基因序列rs3741596位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物。引物：上游5′-CAGGTGGCAATG?GTGGAG-3′，下游5′-TGTCGGTCAGTCTTATGGCT-3′。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，最終濃度為10μmol/L。PCR反應(yīng)體系為30μL，包括基因組DNA 1μL，上、下游引物各0.8μL（10μmol/L），2×MIX混合液15μL，ddH2O 12.4μL。應(yīng)用德國Eppendorf公司生產(chǎn)的PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共進(jìn)行35個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。取3μL PCR產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，并采用凝膠成像系統(tǒng)照相和圖像分析。取506 bp處擴(kuò)增條帶陽性標(biāo)本的PCR產(chǎn)物25μL，委托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行直接測序。應(yīng)用Chromas軟件分析直接測序結(jié)果，利用NCBI網(wǎng)站在線BLAST對所獲得序列進(jìn)行在線檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。應(yīng)用擬合優(yōu)度檢驗(yàn)判斷全部研究對象基因型頻率是否符合Hardy-Weinberg平衡；采用χ2檢驗(yàn)比較KD病例組與對照組及CAL組與NCAL組之間基因型頻率及等位基因頻率分布差異；通過計(jì)算優(yōu)勢比（odds radio，OR）及其95%置信區(qū)間（95%CI）分析KD的發(fā)生及并發(fā)CALs與ORAI1rs3741596位點(diǎn)SNP的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果 按前述PCR反應(yīng)體系及條件擴(kuò)增，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，ORAI1基因rs3741596位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物目標(biāo)片段長度為506 bp。以MarkerⅠ為核酸分子質(zhì)量參照標(biāo)準(zhǔn)，以ddH2O作為空白對照，PCR產(chǎn)物條帶位于500～600 bp之間，擴(kuò)增產(chǎn)物為目標(biāo)片段，符合實(shí)驗(yàn)要求。條帶熒光亮度較強(qiáng)，且附近沒有其他條帶，表明其濃度與純度可達(dá)直接測序的要求。結(jié)果見圖1。

2.2 PCR產(chǎn)物測序結(jié)果 測序所得ORAI1基因rs3741596位點(diǎn)序列與NCBI網(wǎng)站基因庫數(shù)據(jù)（http://www.ncbi.nlm.nlh.gov/BLAST）進(jìn)行對比。對比結(jié)果顯示，PCR產(chǎn)物測序的基因序列和NCBI網(wǎng)站公布的ORAI1基因rs3741596位點(diǎn)的基因序列相符，一致性達(dá)99%。

所有研究對象基因組DNA均檢測到ORAI1基因SNP rs3741596位點(diǎn)，該位點(diǎn)基因型為AA、AG和GG 3種，如圖2所示。其中病例組AA基因型35例，AG基因型9例，GG基因型2例；對照組AA基因型21例，AG基因型3例，GG基因型1例。

2.3 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)ORAI1基因SNP rs3741596 AA、AG及GG 3種基因型在KD病例組的分布（χ2=1.727，P=0.189）及在對照組的分布（χ2=2.778，P=0.096），均符合Hardy-Weinberg平衡定律，達(dá)到遺傳平衡，具有群體代表性。

Fig.1 A electrophoresis of PCR products圖1 PCR產(chǎn)物電泳圖

Fig.2 Sequence diagram of ORAI1 gene rs3741596圖2 ORAI1基因rs3741596位點(diǎn)測序圖

2.4ORAI1基因rs3741596位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分布的比較 KD病例組和對照組間ORAI1基因rs3741596位點(diǎn)AA、AG及GG基因型頻率分布及等位基因頻率分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。CAL組和NCAL組間ORAI1基因rs3741596位點(diǎn)AA、AG和GG基因型頻率分布及等位基因頻率分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。G等位基因可能增加KD患兒并發(fā)CALs的危險性（OR=5.444，95%CI：1.386～21.380）。

Tab.1 Comparison of genotype frequency and allele frequency of ORAI1 gene rs3741596 between KD case group and control group表1 ORAI1基因rs3741596位點(diǎn)KD病例組和對照組基因型及等位基因頻率比較 例（%）

3 討論

由于KD并發(fā)的CALs可能引起的嚴(yán)重后果，預(yù)防CALs的發(fā)生和早期識別CALs的高危人群是眾多科學(xué)家研究的課題。目前臨床上將CALs嚴(yán)重程度分為Ⅰ～Ⅴ級，其中Ⅲ～Ⅴ級冠狀動脈病變較重，預(yù)后較差［8］。國內(nèi)外多項(xiàng)臨床研究表明，低齡（＜1歲或＜6個月）、男性、低白蛋白血癥、血小板增多等可能是CALs發(fā)生的危險因素［8-10］。目前關(guān)于CALs的早期識別在臨床表現(xiàn)及化驗(yàn)檢查方面尋找評價指標(biāo)的研究多缺乏特異性，對于一些化驗(yàn)指標(biāo)很難確定其節(jié)點(diǎn)。韓國一項(xiàng)回顧性研究顯示，近幾年確診的KD患者臨床表現(xiàn)較10年前的患者相對不典型，不完全KD發(fā)病率增高；另外，實(shí)驗(yàn)室檢查中嚴(yán)重（明顯異常）的結(jié)果較前減少，與10年前的KD患者相比，C反應(yīng)蛋白（CRP）及血小板計(jì)數(shù)下降、白蛋白水平增高［11］。本研究從分子生物學(xué)層面，尋找CALs的易感基因，旨在從病因?qū)W角度闡明CALs的高危因素，為進(jìn)一步病因治療提供理論依據(jù)。

Tab.2 Comparison of genotype frequency and allele frequency of ORAI1 gene rs3741596 between CAL group and NCAL group表2 ORAI1基因rs3741596位點(diǎn)CAL組和NCAL組基因型及等位基因頻率分布 例（%）

3.1ORAI1分子結(jié)構(gòu)及生理功能ORAI1基因定位于12q24，后者已被證實(shí)與KD的易感連鎖關(guān)系最密切［最大 LOD 值（MLS）=2.69］［12］。本研究選擇了ORAI1基因rs3741596位點(diǎn)SNP，該位點(diǎn)A突變?yōu)镚，引起非同義突變，使相應(yīng)密碼子編碼的氨基酸由絲氨酸變?yōu)楦拾彼?。每個ORAI1單體在細(xì)胞膜上共跨越4次，在細(xì)胞外形成兩個環(huán)，在胞漿內(nèi)形成一個環(huán)，并且包括N-末端及C-末端。位于細(xì)胞膜上的ORAI1亞基以六聚體形式組成了鈣激活鈣釋放通道（Ca2+release-activated Ca2+channel，CRAC）［13］，被定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的基質(zhì)相互作用分子（stormal interaction molecule，STIM）所激活，介導(dǎo)鈣庫操控的鈣內(nèi)流（store-operated Ca2+entry，SOCE），使位于胞漿中的活化T細(xì)胞核因子（NFAT）去磷酸化，并促進(jìn)后者向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控，引起免疫細(xì)胞活化［14］。而具備遺傳易感性的個體對病原體感染發(fā)生過度的免疫應(yīng)答，引起多種免疫細(xì)胞活化并產(chǎn)生大量細(xì)胞因子，啟動細(xì)胞因子瀑布反應(yīng)，造成血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等損傷，最終引起血管壁結(jié)構(gòu)破壞，是目前比較認(rèn)可的KD發(fā)病機(jī)制假說［15］。

3.2ORAI1基因與血管損傷的關(guān)系 本研究發(fā)現(xiàn)，ORAI1基因rs3741596位點(diǎn)SNP與KD的易感性無關(guān)，而可能與KD并發(fā)CALs有關(guān)，且攜帶G等位基因可能使KD患兒發(fā)生CALs的危險性增高。有研究證實(shí)，SOCE失調(diào)與血管疾?。ㄑ軆?nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞損傷）相關(guān)，ORAI1分子功能改變將直接影響SOCE功能［16］。Yu等［17］研究表明，敲低ORAI1將阻止腫瘤壞死因子（TNF）-α介導(dǎo)的NFATc4核易位，降低細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）及血管細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1）在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）中的表達(dá)及血漿中前炎癥因子水平，繼而抑制單核細(xì)胞與HUVEC的黏附，從而抑制血管內(nèi)皮活化及血管炎癥。另有研究發(fā)現(xiàn)，顯性失活CRAC亞基的過度表達(dá)抑制HUVEC中組胺激發(fā)、STIM1及ORAI1介導(dǎo)的鈣內(nèi)流；反之，STIM1及ORAI1聯(lián)合表達(dá)將增強(qiáng)鈣內(nèi)流，從而證實(shí)ORAI1和STIM1在內(nèi)皮細(xì)胞炎癥信號中發(fā)揮重要作用［18］。眾所周知，血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）是構(gòu)成血管壁的主要成分，參與維持血管正常生理功能。Bisaillon等［19］通過動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，STIM1和ORAI1是血管源性生長因子（PDGF）介導(dǎo)的鈣內(nèi)流及VSMCs遷移過程中的重要組成部分，兩者在體內(nèi)血管損傷及新生內(nèi)膜形成過程中上調(diào)。Avila-Medina等［20］提出，SOCE與許多生理過程相關(guān)，如血管張力調(diào)節(jié)、血管再生、VSMC增殖等；抑制ORAI1會很大程度減弱SOCE，從而抑制激動劑誘導(dǎo)的冠狀動脈收縮。在藥物治療領(lǐng)域，通過抑制ORAI1介導(dǎo)的鈣內(nèi)流可起到預(yù)防冠狀平滑肌細(xì)胞增生的作用，藥物洗脫支架上所用的雷帕霉素就是基于此原理［21］。

綜上，本研究結(jié)果表明，ORAI1基因rs3741596位點(diǎn)SNP可能與KD并發(fā)CALs易感性有關(guān)，攜帶G等位基因可能使KD患兒發(fā)生CALs的危險性增高。其機(jī)制可能為該位點(diǎn)非同義突變致ORAI1蛋白功能改變，引起SOCE增強(qiáng)，使細(xì)胞內(nèi)鈣超載，最終導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞和其他細(xì)胞損傷而形成CALs。推測通過檢測ORAI1基因rs3741596 SNP位點(diǎn)可能會成為篩查KD并發(fā)CALs高危因素的臨床應(yīng)用指標(biāo)，ORAI1可能成為治療炎癥性疾病的新靶標(biāo)，對于制定個體化治療方案及預(yù)后的預(yù)測有重要意義。