陳文榮 胡盈盈 沈芷琦 陳秉初

(浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院 金華 321004)

洋蔥鱗片葉表皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)是生物學(xué)教學(xué)的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，學(xué)生能觀察到細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞壁和細(xì)胞膜等簡(jiǎn)單細(xì)胞結(jié)構(gòu)。經(jīng)典的染色劑為I2-KI試劑，其基本原理為I2與蛋白質(zhì)發(fā)生顯色，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的蛋白質(zhì)濃度較細(xì)胞核內(nèi)的低，細(xì)胞質(zhì)顯淺棕黃色，細(xì)胞核顯深棕黃色。在教學(xué)實(shí)踐中，碘染色所需時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，染色效果單一，觀察效果不佳。有人嘗試使用Feulgen染色法[1]、甲基綠-派洛寧染色法[2]、中性紅染色[3]、孔雀綠染色、ZnO作用等較為創(chuàng)新的染色方法將洋蔥鱗片葉表皮細(xì)胞染色，但實(shí)驗(yàn)步驟較為繁瑣，不適合于中學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)。本文以洋蔥鱗片葉表皮為材料，從有機(jī)試劑(如堿性品紅、亞甲基藍(lán)、固綠、蘇木精等)和無(wú)機(jī)染料[如24.5%H2SO4、飽和Fe2(SO4)3溶液、飽和CuSO4溶液、0.5mol/L Li2SO4溶液等]進(jìn)行單染色和交互染色，以尋求更好的染色效果，豐富植物細(xì)胞染色色系，并為中學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)提供更多的染色方法選擇及更為豐富的染色效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 放置7d左右的洋蔥。試劑： 堿性品紅、固綠、亞甲基藍(lán)、苯胺藍(lán)、核固紅、蘇木精、次甲基藍(lán)、98% H2SO4、Fe2(SO4)3、CuSO4、Li2SO4、碘液、酒精、蒸餾水。

1.2 試劑配制 本研究相關(guān)試劑配制方法如下：

試 劑配置方法核固紅染色液稱取0.500g固綠溶于50mL 95%酒精苯胺藍(lán)染色液稱取0.050g苯胺藍(lán)和1.000g K2HPO4溶于50mL蒸餾水亞甲基藍(lán)染色液稱取0.830g亞甲基藍(lán)溶于50mL蒸餾水(水溫為35℃～40℃),直至完全溶解,再冷卻至20℃固綠染色液稱取0.500g固綠溶于50mL 95%酒精蘇木精染色液稱取0.500g蘇木精溶于50mL無(wú)水酒精,讓其氧化成熟4周次甲基藍(lán)染色液稱取0.050g次甲基藍(lán)溶于50mL 50%酒精堿性品紅染色液稱取0.750g堿性品紅溶解于50mL 70%酒精24.5% H2SO4溶液取98% H2SO4 10mL稀釋3倍飽和Fe2(SO4)3溶液取過(guò)量的Fe2(SO4)3溶于50mL的蒸餾水中,溶解至飽和,過(guò)濾飽和CuSO4溶液取過(guò)量的CuSO4溶于50mL的蒸餾水中,溶解至飽和,過(guò)濾0.5mol/L Li2SO4溶液碘液稱取5.5g Li2SO4溶于少量的蒸餾水中,定容至50mL稱取1.1g I2和2.2g KI溶于少量蒸餾水中,定容至50mL

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟 ①取材： 用鑷子取適量洋蔥的外(內(nèi))表皮，置于載玻片上；②醇洗[4]： 將撕取的洋蔥表皮置于75%酒精中浸泡1min；③水洗： 用緩慢的蒸餾流水洗滌；④染色： 滴加相應(yīng)的染色劑，進(jìn)行染色；⑤水洗： 用緩慢的蒸餾流水沖洗，充分洗去浮色，直至所流下的水為無(wú)色；⑥蓋片觀察： 蓋上蓋玻片，置于顯微鏡下觀察。

1.4 染色方法 具體步驟如下：

(1) 有機(jī)試劑單染色 核固紅、亞甲基藍(lán)、固綠、次甲基藍(lán)進(jìn)行染色，染色時(shí)長(zhǎng)為10min；使用苯胺藍(lán)進(jìn)行染色時(shí)，染色時(shí)長(zhǎng)為15min；使用蘇木精進(jìn)行染色時(shí)，染色時(shí)長(zhǎng)為5min；使用堿性品紅染色時(shí)，染色時(shí)長(zhǎng)為1min。

(2) 無(wú)機(jī)試劑單染色 使用24.5% H2SO4溶液、飽和Fe2(SO4)3溶液染色、飽和CuSO4溶液染色、0.5mol/L Li2SO4溶液進(jìn)行染色時(shí)，染色時(shí)長(zhǎng)均為10min。

(3) 交互染色 12.25% H2SO4+亞甲基藍(lán)、24.5% H2SO4+核固紅、24.5% H2SO4+亞甲基藍(lán)、24.5% H2SO4染色+固綠及碘液+24.5% H2SO4各組別中，前后兩種染色劑均染色7～10min；6.225% H2SO+碘液中，前后兩種染色劑均染色5min；碘液+固綠中，前者染色5min，后者染色25min；固綠+碘液，前者染色10min，后者染色5min；苯胺藍(lán)+核固紅、核固紅+苯胺藍(lán)、苯胺藍(lán)+固綠、核固紅+固綠、固綠+亞甲基藍(lán)和亞甲基藍(lán)染+碘液各組別中，前后兩種染色劑均染色7min；固綠與亞甲基藍(lán)的混合液、品紅與亞甲基藍(lán)的混合液和固綠與堿性品紅的混合液，均染色7～10min。

2 研究結(jié)果

2.1 有機(jī)染料單染色 有機(jī)染料染色效果中，次甲基藍(lán)與堿性品紅的染色效果最好，染色清晰，大部分細(xì)胞著色均一。蘇木精與核固紅的染色效果次之，蘇木精的染色效果與碘液類似，細(xì)胞核呈棕黃色，細(xì)胞質(zhì)呈黃色，但在染色時(shí)間上有所減少；核固紅染色較為清晰，相對(duì)傳統(tǒng)的碘液染色，染色色系上有所突破，但多數(shù)細(xì)胞著色深淺不一，觀察發(fā)現(xiàn)可能是由于核固紅染液中的雜質(zhì)所致。苯胺藍(lán)、亞甲基藍(lán)、固綠的染色效果不佳，對(duì)細(xì)胞質(zhì)的染色效果顯著，而細(xì)胞核未見(jiàn)染色，觀察效果不佳(染色效果圖請(qǐng)掃文后二維碼)。

2.2 無(wú)機(jī)染料單染色 24.5% H2SO4溶液與飽和Fe2(SO4)3溶液染色效果最好，染色清晰，細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核區(qū)分明顯，但是細(xì)胞著色不均一，部分細(xì)胞未被染色。0.5mol/L Li2SO4溶液染色效果次之，細(xì)胞核呈綠色，細(xì)胞質(zhì)呈淺綠色，但細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)顆粒狀，影響觀察。飽和CuSO4溶液染色效果不佳，對(duì)細(xì)胞質(zhì)的染色效果顯著，呈黃色，且大部分細(xì)胞著色，但未對(duì)細(xì)胞核有染色效應(yīng)(染色效果圖請(qǐng)掃文后二維碼)。

2.3 染色劑交互染色 相應(yīng)染色效果如下：

2.3.1 硫酸與其他染色液交互染色 硫酸與染色劑的配合使用導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生質(zhì)壁分離，從而使細(xì)胞膜與細(xì)胞壁的界線更為清晰。相較而言，12.25% H2SO4+亞甲基藍(lán)、24.5% H2SO4+亞甲基藍(lán)、24.5% H2SO4+核固紅、24.5% H2SO4+固綠的染色效果最好，染色清晰，大部分細(xì)胞著色均一，質(zhì)核區(qū)分顯著，細(xì)胞核比細(xì)胞質(zhì)的顏色深，細(xì)胞發(fā)生質(zhì)壁分離，可以更好地區(qū)分細(xì)胞壁與細(xì)胞質(zhì)。6.225% H2SO4+碘液、碘液+24.5% H2SO4的染色效果一般，大部分細(xì)胞著色，細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核可以區(qū)分，但是有黑色雜質(zhì)影響觀察(染色效果圖請(qǐng)掃文后二維碼)。

2.3.2 有機(jī)染料交互染色 有機(jī)染料的交互染色，不僅改變?nèi)旧?，同時(shí)也能改進(jìn)染色劑的著色。相較而言，品紅與亞甲基藍(lán)混合液的染色效果最好，細(xì)胞核呈深紫色，細(xì)胞質(zhì)呈紫色，染色鮮艷清晰，細(xì)胞著色均一，質(zhì)核區(qū)分顯著，且內(nèi)外表皮細(xì)胞染色效果均顯著。苯胺藍(lán)+核固紅、固綠+碘液、固綠+亞甲基藍(lán)、固綠與亞甲基藍(lán)混合液、亞甲基藍(lán)+固綠的染色效果次之，染色較為清晰，大部分細(xì)胞著色，細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核明顯區(qū)分。固綠+碘液和固綠與亞甲基藍(lán)混合液染色后的細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核顏色呈不同色系，效果類似于甲基綠-派洛寧染色法[2]。苯胺藍(lán)+固綠、核固紅+固綠的染色效果一般，大部分細(xì)胞著色，細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核可以區(qū)分，但是有雜質(zhì)影響觀察。核固紅+固綠、苯胺藍(lán)+固綠染色后的細(xì)胞的細(xì)胞壁呈綠色[4]，有助于觀察。亞甲基藍(lán)+碘液、堿性品紅與固綠混合液的染色效果最差，大部分細(xì)胞著色，前者細(xì)胞核染色效果不明顯，后者細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞(染色效果圖請(qǐng)掃文后二維碼)。

在交互染色實(shí)驗(yàn)中，染色劑的書(shū)寫(xiě)順序即為添加順序。若無(wú)特殊交代染色劑的劑量比，劑量比均為1 ∶1；若無(wú)特殊交代實(shí)驗(yàn)材料，實(shí)驗(yàn)材料均為洋蔥鱗片葉外表皮。

3 討論

無(wú)機(jī)染色劑中配以24.5% H2SO4溶液導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生質(zhì)壁分離，從而使細(xì)胞膜與細(xì)胞壁的界線更為清晰，且相較于傳統(tǒng)的碘染色，顏色更為鮮艷(見(jiàn)硫酸與其他染色劑交互實(shí)驗(yàn)染色效果圖)；同時(shí)，24.5% H2SO4溶液的加入使染色時(shí)間顯著縮短，其染色機(jī)理可能是洋蔥表皮細(xì)胞內(nèi)某種物質(zhì)具有類似于酸堿指示劑的作用；也可能是由于H2SO4作為強(qiáng)酸，使蛋白質(zhì)變性所致，但系列濃度的HCl、H3PO4等強(qiáng)酸、中強(qiáng)酸的染色實(shí)驗(yàn)并未觀察到上述染色效果(研究結(jié)果本文未包含)。因此，H2SO4溶液的染色原理仍需進(jìn)一步研究探討。為獲得更好的染色效果，本研究同時(shí)進(jìn)行了H2SO4的濃度梯度染色研究，發(fā)現(xiàn)98%、49%的H2SO4會(huì)嚴(yán)重破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，細(xì)胞呈“解體”狀；而12.25% H2SO4無(wú)染色現(xiàn)象(相關(guān)結(jié)果本文未包含)。

染色時(shí)間會(huì)影響染色效果： 時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，原染色為橙色的細(xì)胞會(huì)變成綠色，這可能是由于顯色產(chǎn)物結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，被空氣氧化或者進(jìn)一步與胞內(nèi)其他物質(zhì)反應(yīng)所致。而無(wú)機(jī)試劑中的飽和Fe2(SO4)3溶液和飽和CuSO4溶液能使細(xì)胞著色，其染色機(jī)理可能是有色金屬鹽使蛋白質(zhì)變性并產(chǎn)生有色絡(luò)合物(見(jiàn)硫酸與其他染色劑交互實(shí)驗(yàn)染色效果圖)。但由于金屬離子進(jìn)入表皮細(xì)胞不均衡，因此染色效果差于有機(jī)染料，但是在染色劑的種類上有所突破，有利于擴(kuò)大細(xì)胞染色劑的選擇范圍。在各類常見(jiàn)的有機(jī)染色劑染色發(fā)現(xiàn)，堿性品紅染色效應(yīng)極強(qiáng)，染色速度也最快，只需染色1min即可觀察；且在交互實(shí)驗(yàn)中，絕大部分與堿性品紅組合的實(shí)驗(yàn)，另一種染色劑的效果會(huì)被完全地掩蓋(見(jiàn)有機(jī)染色劑交互染色效果圖)。這可能是由于在近中性范圍內(nèi)堿性品紅與DNA有較強(qiáng)的結(jié)合[4]。

染色劑組合染色往往能改進(jìn)染色效果，但部分染色組合是染色劑組分獨(dú)立染色結(jié)果，酸性染料使細(xì)胞質(zhì)著色、堿性染料使細(xì)胞核著色[5]。而快速細(xì)胞染色劑FME也是根據(jù)酸性、堿性染料的共同作用使細(xì)胞各結(jié)構(gòu)染色。同時(shí)，各染色劑的劑量比會(huì)顯著影響染色效果，在甲基綠—派洛寧染色法較好的配比為3 ∶2和1 ∶1[2]；而堿性品紅與亞甲基藍(lán)混合液染色效果最好的配比是1 ∶1，當(dāng)配比為1 ∶4和1 ∶6會(huì)出現(xiàn)類似色素帶問(wèn)題。另外，單染色時(shí)對(duì)細(xì)胞核染色效果不明顯的染色劑與24.5%H2SO4溶液共同作用時(shí)，對(duì)細(xì)胞核的染色效果明顯增強(qiáng)(見(jiàn)有機(jī)染料單染色效果圖和硫酸與其他染色劑交互染色效果圖)，這可能是由于H2SO4中的H+使細(xì)胞核膜失去選擇透性，染色劑分子進(jìn)入細(xì)胞核，使細(xì)胞核染色。

4 小結(jié)

根據(jù)研究結(jié)果，值得借鑒參考的有： ①紅色色系中，堿性品紅單染色和24.5% H2SO4+核固紅的染色效應(yīng)好；②黃色色系中，24.5% H2SO4溶液的染色見(jiàn)效快，且獲取試劑方便；③綠色色系中，飽和Fe2(SO4)3溶液和24.5% H2SO4+固綠的染色效果佳；④藍(lán)色色系中，次甲基藍(lán)、12.25% H2SO4+亞甲基藍(lán)和苯胺藍(lán)+核固紅的染色效果好。

(*通信作者)