王 穎

(人民教育出版社生物室 北京 100081)

肺炎鏈球菌是一種革蘭氏陽(yáng)性菌，能引起人的肺炎和呼吸系統(tǒng)的其他疾病。1881年，美國(guó)的喬治·斯滕伯格(George Sternberg)和法國(guó)的路易斯·巴斯德(Louis Pasteur)分別分離得到這種細(xì)菌，最初它被命名為Pneumococcus。1920年改稱肺炎雙球菌(Diplococcuspneumoniae)。因?yàn)樗c鏈球菌非常相似，1974年被正式命名為肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)。這種菌對(duì)小鼠也具有極大的殺傷力，會(huì)導(dǎo)致小鼠死亡。

1 格里菲思實(shí)驗(yàn)

1923年，英國(guó)衛(wèi)生部病理實(shí)驗(yàn)室的弗雷德里克·格里菲思(Frederick Griffith， 1879—1941)發(fā)現(xiàn)肺炎鏈球菌的菌落有兩種類型： 一種是光滑的圓頂形，形態(tài)較為規(guī)則，這種菌有莢膜，能引起小鼠死亡，被稱為光滑型(Smooth，S型)；另一種菌落為顆粒狀、不規(guī)則，這種菌無(wú)莢膜，是減毒的，不會(huì)導(dǎo)致小鼠死亡，被稱為粗糙型(Rough，R型)。格里菲思發(fā)現(xiàn)S型菌(以下簡(jiǎn)稱S菌)經(jīng)傳代培養(yǎng)可以轉(zhuǎn)變?yōu)镽型菌(以下簡(jiǎn)稱R菌)。當(dāng)時(shí)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的肺炎鏈球菌根據(jù)莢膜多糖的不同可分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型等。每種類型的肺炎鏈球菌都有光滑品系S菌和粗糙品系R菌[1]。

格里菲思將不同類型的活的R菌分別與加熱致死的S菌同時(shí)注入小鼠體內(nèi)，觀察小鼠的存活，并從小鼠體內(nèi)分離和鑒定肺炎鏈球菌。在他的一組實(shí)驗(yàn)中，將活的Ⅰ型R菌和加熱致死的Ⅱ型S菌同時(shí)注入小鼠體內(nèi)，幾天后小鼠死亡，從小鼠體內(nèi)分離出活的Ⅱ型S菌。這種轉(zhuǎn)化不僅是同型的R菌轉(zhuǎn)化為S菌，還有Ⅰ型轉(zhuǎn)化為Ⅱ型[2]。

是什么原因?qū)е垄裥偷腞菌轉(zhuǎn)化為Ⅱ型的S菌呢？新產(chǎn)生的Ⅱ型S菌的莢膜多糖來(lái)自哪里？格里菲思于1928年發(fā)表論文介紹了上述實(shí)驗(yàn)并作出解釋： 死亡的小鼠體內(nèi)(受體細(xì)胞)保留了合成Ⅱ型S菌莢膜多糖的物質(zhì)，它能夠促使Ⅰ型R型活細(xì)菌轉(zhuǎn)化為Ⅱ型S型活細(xì)菌[2]。格里菲思沒(méi)有意識(shí)到，將R菌轉(zhuǎn)化為S菌的是加熱致死的S菌中的活性物質(zhì)，即后人所說(shuō)的“轉(zhuǎn)化因子”，他沒(méi)有繼續(xù)探索遺傳物質(zhì)的本質(zhì)。后來(lái)，格里菲思不幸死于1941年德國(guó)對(duì)倫敦發(fā)動(dòng)的一場(chǎng)轟炸中[3]。

2 艾弗里及其合作者的實(shí)驗(yàn)

在格里菲思發(fā)表論文兩年后的1930年，美國(guó)洛克菲勒研究所奧斯瓦爾德·艾弗里(Oswald Avery， 1877—1955)實(shí)驗(yàn)室的亨利·道森(Henry Dawson)和理查德·夏(Richard Sia)實(shí)現(xiàn)了肺炎鏈球菌的離體轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。他們?cè)诤锌筊血清和加熱致死的S菌的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)R菌，結(jié)果產(chǎn)生了活的S菌[4]。后來(lái)，艾弗里實(shí)驗(yàn)室的詹姆斯·阿洛韋(James Alloway)將S菌過(guò)濾，除去一些細(xì)胞組分，得到一種無(wú)細(xì)胞的提取液，并用提取液進(jìn)行體外轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)獲得成功[5]。1934年，科林·麥克勞德(Colin MacLeod， 1909—1972)加入了艾弗里實(shí)驗(yàn)室，他同艾弗里一起用阿洛韋的體外系統(tǒng)進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。1941年，他們已經(jīng)很有信心地認(rèn)為轉(zhuǎn)化因子是“胸腺類的核酸”[1]。1943年3月，艾弗里首先在洛克菲勒理事會(huì)上介紹了他們的實(shí)驗(yàn)過(guò)程和結(jié)果，并于1944年發(fā)表了這個(gè)經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)。

他們將S菌用去氧膽酸鹽溶液漂洗數(shù)次，用乙醇沉淀，得到黏性的乳白色沉淀。將沉淀溶于鹽溶液，然后用氯仿抽提2～3次除去蛋白，再用乙醇沉淀。將沉淀溶于鹽溶液，加入能夠水解多糖的酶，37℃消化4～6 h后鑒定溶液中的多糖已除去。再用氯仿抽提1次除去水解糖的酶和殘留蛋白，然后用乙醇沉淀。他們就這樣從75 L培養(yǎng)物中得到10～25 mg沉淀，然后將沉淀溶于鹽溶液制成細(xì)胞提取物。他們首先用Ⅲ型S菌的細(xì)胞提取物與活的Ⅱ型R菌混合進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，并獲得成功。接著，將細(xì)胞提取物用不同的酶進(jìn)行處理后，再與活的Ⅱ型R菌混合進(jìn)行轉(zhuǎn)化。具體分這樣幾組： ①細(xì)胞提取物用蛋白酶處理，結(jié)果能夠轉(zhuǎn)化；②細(xì)胞提取物用RNA酶處理，能夠轉(zhuǎn)化；③細(xì)胞提取物用DNA酶處理，不能轉(zhuǎn)化；④細(xì)胞提取物用脂酶處理，能夠轉(zhuǎn)化[6]。只有DNA酶能夠阻止轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，這表明被DNA酶消化分解的DNA極可能就是細(xì)胞提取物中有活性的“轉(zhuǎn)化因子”。接下來(lái)，他們分析了“轉(zhuǎn)化因子”的理化特征： 轉(zhuǎn)化因子的分子量很大，分子氮磷比約為1.67，在260nm的紫外線照射時(shí)具有最大的吸收峰值，檢測(cè)DNA的二苯胺反應(yīng)結(jié)果呈強(qiáng)陽(yáng)性，檢測(cè)RNA的苔黑酚檢測(cè)結(jié)果是弱陽(yáng)性，兩種檢測(cè)蛋白質(zhì)的方法結(jié)果都是陰性，等等。這些理化特征或測(cè)試反應(yīng)的結(jié)果都與DNA的極為相似。

艾弗里在論文的結(jié)尾處寫道：“本文提出的證據(jù)支持以下觀點(diǎn)： 脫氧核糖類型的核酸是肺炎鏈球菌Ⅲ型轉(zhuǎn)化因子的基本單位。”艾弗里根據(jù)這些實(shí)驗(yàn)證據(jù)得出上述結(jié)論已經(jīng)有足夠的說(shuō)服力，但是當(dāng)時(shí)科學(xué)界普遍認(rèn)為蛋白質(zhì)才是遺傳物質(zhì)，因此艾弗里在論文中也曾十分謹(jǐn)慎地說(shuō)：“當(dāng)然也有可能，這種物質(zhì)的生物學(xué)活性并不是核酸的一種遺傳特性，而是由于某些微量的其他物質(zhì)所造成的，這些微量物質(zhì)或者吸附在它上面，或者與它密切結(jié)合在一起，因此檢測(cè)不出來(lái)[6]。”

3 艾弗里的結(jié)論引發(fā)質(zhì)疑

艾弗里的論文一經(jīng)發(fā)表就引發(fā)質(zhì)疑，質(zhì)疑點(diǎn)主要是： 轉(zhuǎn)化因子究竟是DNA還是和DNA混在一起的少量蛋白質(zhì)。這些質(zhì)疑既與“細(xì)胞提取物不夠純”的實(shí)際情況有關(guān)，還與當(dāng)時(shí)科學(xué)界對(duì)DNA和蛋白質(zhì)已形成的共識(shí)密不可分。

20世紀(jì)初，科學(xué)家已經(jīng)知道核酸是由許多核苷酸單元聚合而成的化合物。德國(guó)生化學(xué)家卡爾·科賽爾(Karl Kossel， 1853—1927)發(fā)現(xiàn)核酸由堿基、磷酸和糖組成，并探明了組成核苷酸的四種堿基。1909年，美國(guó)生化學(xué)家費(fèi)伯斯·列文(Phoebus Levene， 1869—1940)提出了核苷酸的概念、核苷酸是核酸的基本組成單位。他明確將核酸細(xì)分為核糖核酸(RNA)和脫氧核糖核酸(DNA)，并提出四核苷酸假說(shuō)： 四個(gè)互不相同的核苷酸連接構(gòu)成四核苷酸，四核苷酸連接組成DNA分子。這個(gè)假說(shuō)認(rèn)為DNA鏈?zhǔn)菃握{(diào)重復(fù)的分子[7]。這可能是因?yàn)榱形脑诜治鯠NA結(jié)構(gòu)時(shí)采用了劇烈的提取方法，破壞了DNA的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致他將DNA視作分子量很小(1500 D)的分子[8]。當(dāng)時(shí)“四核苷酸假說(shuō)”深入人心，并促進(jìn)了蛋白質(zhì)的研究。進(jìn)入20世紀(jì)，12種基本氨基酸已被發(fā)現(xiàn)，到1940年，其他8種基本氨基酸也一一被揭示。很多科學(xué)家認(rèn)為以20種氨基酸為基本單位的蛋白質(zhì)似乎含有無(wú)數(shù)復(fù)雜且不重復(fù)的遺傳信息。而艾弗里實(shí)驗(yàn)中的細(xì)胞提取物含有微量的蛋白質(zhì)，因此，他們就不接受艾弗里的實(shí)驗(yàn)結(jié)論。

持懷疑態(tài)度的還有“噬菌體小組”的多位成員。該小組的核心人物是馬克斯·德爾布呂克(Max Delbrück， 1906—1981)、薩爾瓦多·盧里亞(Salvador Luria， 1912—1991)和阿爾弗雷德·赫爾希(Alfred Hershey， 1908—1997)[9]。許多取得杰出成就的科學(xué)家都出自這個(gè)小組，如詹姆斯·沃森(James Watson， 1928— )、馬修·梅塞爾森(Matthew Meselson， 1930— )、富蘭克林·斯塔爾(Franklin Stahl， 1929— )等。當(dāng)時(shí)，德爾布呂克和噬菌體小組的大多數(shù)成員相信四核苷酸假說(shuō)，因此并不相信艾弗里的結(jié)論。他們認(rèn)為DNA只是一種單調(diào)乏味的大分子，怎么可能是遺傳物質(zhì)的載體呢？

反對(duì)艾弗里的還包括他的同事、核酸研究權(quán)威阿爾弗雷德·米爾斯基(Alfred Mirsky， 1900—1974)。米爾斯基嘗試從多種生物材料中提取核酸和蛋白質(zhì)。1946年，他從Ⅲ型肺炎鏈球菌中提取了核酸和蛋白質(zhì)，并重復(fù)了艾弗里的實(shí)驗(yàn)，但是因?yàn)楹茈y獲得不含蛋白質(zhì)的純DNA，因此選擇質(zhì)疑艾弗里。1949年，米爾斯基發(fā)現(xiàn)同種生物不同細(xì)胞中的DNA含量相同，體細(xì)胞DNA含量是精子含量的兩倍。這個(gè)結(jié)論本可以支持DNA是遺傳物質(zhì)，但他仍然不相信僅靠DNA就會(huì)攜帶遺傳信息。

4 更多研究讓人們確信DNA就是遺傳物質(zhì)

面對(duì)爭(zhēng)議，艾弗里的研究團(tuán)隊(duì)細(xì)化實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)證據(jù)。他們采取的方法有： ①優(yōu)化提取轉(zhuǎn)化因子的方法，提高轉(zhuǎn)化因子的種類、產(chǎn)量和純度，將蛋白質(zhì)最大污染量降至0.02%；②純化DNA酶，1944年他們?cè)趯?shí)驗(yàn)中使用的DNA酶并非純化的DNA酶，1946年，麥卡蒂?gòu)呐Ｒ戎屑兓疍NA酶，并在轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中稀釋該DNA酶，致使無(wú)法檢測(cè)到蛋白水解酶活性[10]。

也有科學(xué)家利用其他實(shí)驗(yàn)材料取得了與艾弗里等人相同的結(jié)果。1945年11月，法國(guó)的安德烈·博伊文(André Boivin)宣布： 他成功地實(shí)現(xiàn)了大腸桿菌的轉(zhuǎn)化。他們用從S2型的S菌(大腸桿菌)提取到的核酸去培養(yǎng)S3型的R菌，結(jié)果獲得了S2型的S菌。而且，他們也能使S3型轉(zhuǎn)化為S1型[1]。

其他科學(xué)家的發(fā)現(xiàn)則徹底否定了四核苷酸假說(shuō)。首先，1934年卡斯珀森(Torbj?rn Caspersson)用過(guò)濾的方法得到核酸，他推測(cè)核酸是比蛋白質(zhì)還要大的大分子。1938年，卡斯珀森與席格納(Rudolf Signer)合作得到了分子量為50萬(wàn)、100萬(wàn)道爾頓的DNA分子。這就排除了“DNA是一個(gè)小分子”的反對(duì)意見。其次，美國(guó)生化學(xué)家埃爾文·查哥夫(Erwin Chargaff， 1905—2002)發(fā)現(xiàn)： 不同生物DNA中四種堿基的比例并不一致，但是腺嘌呤(A)總是與胸腺嘧啶(T)含量一致，鳥嘌呤(G)總是與胞嘧啶(C)一致[11]。這個(gè)發(fā)現(xiàn)徹底否定了四核苷酸假說(shuō)，為人們接受DNA是遺傳物質(zhì)掃清了障礙。

后來(lái)，赫爾希和蔡斯(Martha Chase， 1927—2003)的噬菌體侵染實(shí)驗(yàn)再次證明DNA是遺傳物質(zhì)。他們發(fā)現(xiàn)，在噬菌體感染未被同位素標(biāo)記的大腸桿菌后，35S的蛋白質(zhì)外殼留在細(xì)菌外面，而32P的DNA則出現(xiàn)在細(xì)菌內(nèi)部。如果讓噬菌體與細(xì)胞碎片混合，35S就吸附于細(xì)胞的碎片上，溶液中則出現(xiàn)了32P的DNA。接著，他們用32P或35S標(biāo)記的T2噬菌體分別感染大腸桿菌，經(jīng)過(guò)短時(shí)間的溫育，再用攪拌器攪拌(使吸附在細(xì)菌上的噬菌體與細(xì)菌分離)、離心(讓上清液中析出重量較輕的T2噬菌體顆粒)。離心管的沉淀物中留下被感染的大腸桿菌。離心后，檢查上清液和沉淀物中的放射性物質(zhì)發(fā)現(xiàn)： 用35S標(biāo)記的一組感染實(shí)驗(yàn)，放射性同位素主要分布在上清液中，子代噬菌體幾乎都不含35S；用32P標(biāo)記的一組實(shí)驗(yàn)，放射性的同位素主要分布在試管的沉淀物中，約有30%的32P出現(xiàn)在子代噬菌體中[12]。當(dāng)這個(gè)結(jié)果公布后，起初質(zhì)疑艾弗里的噬菌體小組則一下子接受了這個(gè)結(jié)論。1953年，赫爾希-蔡斯實(shí)驗(yàn)與DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型同時(shí)在冷泉港的學(xué)術(shù)會(huì)議上展示，這也使得前者變得引人注目，科學(xué)家自此普遍接受DNA是遺傳物質(zhì)。

5 正確理解艾弗里實(shí)驗(yàn)的價(jià)值，厘清三個(gè)重要實(shí)驗(yàn)的關(guān)系

作為發(fā)現(xiàn)遺傳物質(zhì)本質(zhì)的第一人，艾弗里的研究結(jié)論長(zhǎng)期不被接受。在介紹分子生物學(xué)歷史的早期著作中，赫爾希-蔡斯實(shí)驗(yàn)被視為證明DNA是遺傳物質(zhì)的唯一實(shí)驗(yàn)。事實(shí)上，艾弗里是人類第一次用確鑿的實(shí)驗(yàn)證據(jù)說(shuō)明遺傳物質(zhì)的本質(zhì)，揭示了DNA的重要性。查哥夫正是知道了艾弗里的研究結(jié)論后，才轉(zhuǎn)而研究DNA。而沃森和克里克正是知道了查哥夫法則，才對(duì)搭建的模型進(jìn)行調(diào)整從而解析了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)。因此，艾弗里的卓越貢獻(xiàn)不容忽視。

格里菲思實(shí)驗(yàn)是艾弗里等人探究遺傳物質(zhì)本質(zhì)的基礎(chǔ)。格里菲思利用肺炎鏈球菌做轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，開辟了用細(xì)菌研究遺傳的新領(lǐng)域，并取得重要結(jié)論。而艾弗里的一系列研究是對(duì)格里菲思實(shí)驗(yàn)的延伸，并取得了里程碑式的結(jié)論，第一次證明DNA是遺傳物質(zhì)。赫爾希-蔡斯實(shí)驗(yàn)則是對(duì)艾弗里實(shí)驗(yàn)結(jié)論的進(jìn)一步支持，他們利用噬菌體作為研究材料，巧妙設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，顯示出杰出科學(xué)家的品質(zhì)和能力，但是研究的目的追隨了艾弗里。

6 遺傳物質(zhì)的研究過(guò)程反映了科學(xué)的本質(zhì)

科學(xué)不僅表現(xiàn)為系統(tǒng)化的知識(shí)體系，而且還包含有獨(dú)特的科學(xué)方法和科學(xué)精神[13]。毫無(wú)疑問(wèn)，對(duì)遺傳物質(zhì)的探索就是科學(xué)發(fā)展的過(guò)程，對(duì)這段歷史的梳理有助于理解科學(xué)的本質(zhì)。

科學(xué)之路充滿了觀點(diǎn)的碰撞和論爭(zhēng)?？茖W(xué)是一種不斷發(fā)展和自我矯正的探究過(guò)程。從1923年格里菲思開始研究肺炎鏈球菌，歷經(jīng)近30年，人們才確信DNA是遺傳物質(zhì)。過(guò)程雖然曲折，但人類最終探明了遺傳物質(zhì)的本質(zhì)。這充分反映出世界是可以被認(rèn)知的，科學(xué)知識(shí)并非絕對(duì)真理，而是在不斷的修正中完善的；反映出科學(xué)知識(shí)所具有的可認(rèn)識(shí)性、開放性、可重復(fù)性、累積性等。

科學(xué)方法和理性思維在科學(xué)發(fā)現(xiàn)中具有重要作用?？茖W(xué)知識(shí)是科學(xué)家基于證據(jù)、運(yùn)用科學(xué)方法、經(jīng)過(guò)巧妙的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和嚴(yán)密的邏輯推理獲得的。對(duì)遺傳物質(zhì)的探索，科學(xué)家充分運(yùn)用了多種科學(xué)方法，展示出他們的理性思維。首先，科學(xué)家都采用了實(shí)驗(yàn)法來(lái)獲取事實(shí)和證據(jù)，實(shí)驗(yàn)方法有： 肺炎鏈球菌的體內(nèi)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)體系、體外轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)體系(該體系簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)過(guò)程、為鑒定轉(zhuǎn)化因子打下基礎(chǔ))、微生物培養(yǎng)技術(shù)、同位素標(biāo)記技術(shù)、噬菌體技術(shù)等。而且，以細(xì)菌、病毒作為研究模型，充分利用實(shí)驗(yàn)對(duì)象材料簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)周期短、方便操作等優(yōu)點(diǎn)。其次，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上，艾弗里從混合物中有選擇地除去一種物質(zhì)，通過(guò)觀察轉(zhuǎn)化活性，確定這種物質(zhì)是否起作用，這其實(shí)是一種“排除法”。噬菌體侵染實(shí)驗(yàn)則是設(shè)法將DNA和蛋白質(zhì)分開，實(shí)際也是“排除法”。由此可見，他們的研究對(duì)象不同，實(shí)驗(yàn)方法不同，但基于相似的思維方法，得出了同樣的實(shí)驗(yàn)結(jié)論。

呈現(xiàn)了科學(xué)家質(zhì)疑、求真、實(shí)證等科學(xué)精神?？茖W(xué)注重證據(jù)和基于證據(jù)的邏輯推理。在遺傳物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)過(guò)程中，基于重要實(shí)驗(yàn)所得到的結(jié)論都充分體現(xiàn)了“證據(jù)”的作用。艾弗里等人最初制備的粗提物中含有少量蛋白質(zhì)污染，但他們一直設(shè)法提高粗提物和酶的純度，這也是試圖獲得更可靠的證據(jù)。這些都反映出科學(xué)家的實(shí)證、探索、求真的科學(xué)精神。