李日增 夏建福 蔣義 鄭昭科

[摘要] 目的 探討結(jié)直腸癌組織中缺氧誘導(dǎo)因子-1a（HIF-1a）與microRNA-138（miR138）的表達(dá)變化及與其患者預(yù)后的相關(guān)性。 方法 選擇2016年1月～2017年8月科室收治的結(jié)直腸患者70例，設(shè)為觀察組，患者行手術(shù)治療，術(shù)中取結(jié)直腸癌病灶組織；以癌旁組織設(shè)為對(duì)照組。采用免疫組織化學(xué)法完成兩組HIF-1α與miR138蛋白表達(dá)測(cè)定，記錄結(jié)直腸癌組織患者病理資料，包括：年齡、腫瘤直徑、腫瘤分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及術(shù)后復(fù)發(fā)情況，對(duì)上述病理資料進(jìn)行單因素分析；采用COX回歸模型分析結(jié)直腸癌組織中HIF-1α與miR138與患者預(yù)后的相關(guān)性。 結(jié)果 觀察組結(jié)腸癌組織中HIF-1α與miR138陽(yáng)性率，均高于對(duì)照組（P<0.05）；單因素及COX回歸模型分析結(jié)果表明：結(jié)直腸癌組織中HIF-1α與miR138陽(yáng)性率與性別、年齡無(wú)相關(guān)性（P>0.05）；結(jié)直腸癌組織中HIF-1α與miR138陽(yáng)性率與腫瘤大小、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度及浸潤(rùn)呈正相關(guān)性（P<0.05）。 結(jié)論 結(jié)直腸癌組織中HIF-1α與miR138均呈高表達(dá)，其表達(dá)水平與患者預(yù)后具有一定的相關(guān)性，加強(qiáng)患者HIF-1α與miR138水平測(cè)定能評(píng)估患者預(yù)后，值得推廣應(yīng)用。

[關(guān)鍵詞] 結(jié)直腸癌組織；缺氧誘導(dǎo)因子-1α；microRNA-138；表達(dá)變化；COX回歸模型

[中圖分類號(hào)] R735.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2018）21-0021-04

[Abstract] Objective To investigate the expression of hypoxia-inducible factor-1α（HIF-1α） and microRNA-138 （miR138） in colorectal cancer and its correlation with prognosis. Methods A total of 70 colorectal patients were selected from January 2016 to August 2017 as the observation group. The patients were treated with surgery and the colorectal cancer tissue was taken during the operation. The adjacent tissue was used as a control group. The expression of HIF-1α and miR138 protein in the two groups was determined by immunohistochemical method. The pathological data of colorectal cancer tissues were recorded including age， tumor diameter， tumor stage， differentiation， lymph node metastasis and postoperative recurrence. Data were analyzed by univariate analysis； COX regression models were used to analyze the association between HIF-1α and miR138 in patients with colorectal cancer and their prognosis. Results The positive rates of HIF-1α and miR138 in the observation group were higher than those in the control group（P<0.05）. The results of univariate and COX regression analysis showed that there was no correlation between the positive rates of HIF-1α and miR138 in colorectal cancer tissues and gender， age（P>0.05）. The positive rates of HIF-1α and miR138 in colorectal cancer tissues were positively correlated with tumor size， tumor stage， lymph node metastasis， differentiation and infiltration（P<0.05）. Conclusion The expressions of HIF-1α and miR138 in colorectal cancer tissue are high. The expression level of HIF-1α and miR138 is correlated with the prognosis of patients. Strengthening the measurement of HIF-1α and miR138 levels can evaluate the prognosis of patients and is worthy of popularization and application.

[Key words] Colorectal cancer tissue； Hypoxia-inducible factor-1α； MicroRNA-138； Expression changes； COX regression model

大腸癌屬于臨床上發(fā)生率較高的惡性腫瘤，包括結(jié)腸癌與直腸癌。文獻(xiàn)報(bào)道顯示[1]：大腸癌發(fā)病率由低到高依次為直腸、乙狀結(jié)腸、升結(jié)腸及降結(jié)腸，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，多與生活方式、遺傳及大腸腺瘤有關(guān)，且疾病發(fā)生率呈年輕化趨勢(shì)，影響我國(guó)居民健康及生活。目前，臨床上對(duì)于結(jié)直腸癌以手術(shù)治療為主，通過(guò)手術(shù)能切除病灶組織，延長(zhǎng)患者壽命，但是多數(shù)患者術(shù)后5年生存率僅50.0%[2]。因此，加強(qiáng)結(jié)直腸癌患者早期診斷、治療對(duì)改善患者預(yù)后具有重要的意義。缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用，能促進(jìn)腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移，能在多種機(jī)制下促進(jìn)腫瘤糖酵解[3]。microRNA屬于是一種單鏈非編碼小片段RNA調(diào)控分子，能參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育、分化及凋亡[4]。microRNA-138是microRNA的一種，在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用。因此，加強(qiáng)HIF-1α與miR138水平測(cè)定及研究與患者預(yù)后的相關(guān)性能為患者治療提供依據(jù)和參考。本課題以2016年1月～2017年8月科室收治的結(jié)直腸患者70例，探討結(jié)直腸癌組織中HIF-1α與miR138的表達(dá)變化及與其患者預(yù)后的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2016年1月～2017年8月科室收治的結(jié)直腸患者70例，設(shè)為觀察組，男42例，女28例，年齡36～75歲，平均（57.58±5.61）歲。腫瘤分期：Ⅰ+Ⅱ期39例，Ⅲ+Ⅳ期31例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：轉(zhuǎn)移25例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移45例；是否浸潤(rùn)：發(fā)生浸潤(rùn)21例，未發(fā)生浸潤(rùn)49例。分化程度：低分化23例，中分化21例，高分化26例。預(yù)后：預(yù)后良好52例，預(yù)后差18例。以癌旁組織設(shè)為對(duì)照組。本課題得到醫(yī)院倫理委員會(huì)同意，患者對(duì)檢測(cè)方案簽署同意書(shū)。

1.2 納入、排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合結(jié)直腸癌臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，患者均經(jīng)手術(shù)病理檢查最終確診；（2）能耐受手術(shù)治療，能遵循醫(yī)囑完成相關(guān)檢查、治療者。

排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并嚴(yán)重心、肝、腎功能異常及伴有明顯精神異常者；（2）合并多種惡性腫瘤者；（3）合并糖尿病、高血壓、慢性阻塞性肺疾病等慢性疾病者[6]。

1.3 主要儀器和試劑

本課題所需的儀器與試劑包括：包埋機(jī)（型號(hào)EG1150H）、脫水劑（型號(hào)ASP300S）、鼠抗人HIF-1α單克隆抗體（NBP1-30333）、鼠抗人miR138單克隆抗體、EDTA（ZLI9069）、免疫組化試劑盒（SP9001），其廠家見(jiàn)表1。

1.4 方法

（1）檢測(cè)方法。采用免疫組織化學(xué)法完成兩組HIF-1α與miR138蛋白表達(dá)測(cè)定：①標(biāo)本采集。圍術(shù)期取病灶部位組織，采用免疫組織化學(xué)法測(cè)定兩組HIF-1α與miR138蛋白表達(dá)。②檢測(cè)方法。向制備的切片組織中放入1份30.0%H2O2及10份蒸餾水，加入內(nèi)源性酶常溫下10 min滅火，采用蒸餾水連續(xù)3次洗滌。將切片放置在0.01 M枸櫞酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)溶液pH值為6.0，利用電爐加熱，煮沸后間隔5 min，連續(xù)反復(fù)2次，常溫下冷卻后加入PBS進(jìn)行2次洗滌，常溫下加入濃度5%BSA封閉液，甩去多余液體后加入一滴HIF-1α與miR138蛋白（稀釋濃度為1：100）單克隆抗體，采用PBS3次洗滌，每次2 min。采用DBA顯色試劑盒中在1 mL底物中加入1滴HIF-1α與miR138蛋白二抗，混合均勻后制備DBA工作液，常溫下顯色，完畢后利用蘇木素復(fù)染、脫水、透明后封片，倒置顯微鏡下觀察陽(yáng)性細(xì)胞時(shí)數(shù)量占總細(xì)胞數(shù)量的比例，每個(gè)標(biāo)本測(cè)定3次，取平均值[7]。③判定方法。以細(xì)胞膜和（或）細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆?；驁F(tuán)裝視為陽(yáng)性。參考奧爾雷德評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)從細(xì)胞陽(yáng)性數(shù)（1～4分）及染色強(qiáng)度（0～12分）進(jìn)行判斷，得分越高，陽(yáng)性率越高。評(píng)定時(shí)每個(gè)標(biāo)本連續(xù)測(cè)定3次，在200倍光鏡下取5個(gè)視野，取平均值[8]。（2）病理資料的統(tǒng)計(jì)。采用免疫組織化學(xué)法完成兩組HIF-1α與miR138蛋白表達(dá)測(cè)定，記錄結(jié)直腸癌組織患者病理資料，包括：年齡、腫瘤直徑、腫瘤分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及術(shù)后復(fù)發(fā)情況，對(duì)上述病理資料進(jìn)行單因素分析[9]；參考WHO實(shí)體瘤標(biāo)準(zhǔn)對(duì)患者手術(shù)后治療效果從CR（完全緩解）、PR（部分緩解）、PD（疾病進(jìn)展）、SD（疾病穩(wěn)定）角度進(jìn)行評(píng)估，將CR+PR視為預(yù)后良好；PD+SD視為預(yù)后差。（3）相關(guān)性。采用COX回歸模型分析結(jié)直腸癌組織中HIF-1α與miR138與患者預(yù)后的相關(guān)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS18.0軟件處理，計(jì)數(shù)資料行χ2檢驗(yàn)，采用[n（%）]表示，計(jì)量資料行t檢驗(yàn)，采用（x±s）表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組HIF-1α與miR138陽(yáng)性率比較

觀察組結(jié)腸癌組織中HIF-1α與miR138陽(yáng)性率，均高于對(duì)照組（P<0.05）。見(jiàn)表2、封三圖1。

2.2 結(jié)直腸癌組織中HIF-1α與miR138陽(yáng)性率表達(dá)單因素分析

單因素結(jié)果表明：結(jié)直腸癌組織中HIF-1α與miR138陽(yáng)性率與性別、年齡無(wú)相關(guān)性（P>0.05）；結(jié)直腸癌組織中HIF-1α與miR138陽(yáng)性率與腫瘤大小、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度及浸潤(rùn)呈正相關(guān)性（P<0.05）。見(jiàn)表3。

2.3 結(jié)直腸癌組織中HIF-1α與miR138與預(yù)后的相關(guān)性研究

COX回歸模型分析結(jié)果表明：結(jié)直腸癌組織中HIF-1α與miR138陽(yáng)性率與腫瘤大小、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度及浸潤(rùn)呈正相關(guān)性（P<0.05）。見(jiàn)表4。

3 討論

結(jié)直腸癌均為臨床上常見(jiàn)的惡性腫瘤，且發(fā)生率呈上升、年齡化趨勢(shì)，嚴(yán)重影響我國(guó)居民健康[10]。由于結(jié)直腸癌發(fā)病早期臨床癥狀缺乏特異性，多數(shù)患者一旦確診，已經(jīng)是中、晚期，喪失了最佳治療時(shí)機(jī)。因此，加強(qiáng)患者早期診斷、治療對(duì)改善患者預(yù)后具有重要的意義[11]。

HIF-1具有HIF-1α、HIF-1β兩種亞型，而HIF-1α是腫瘤細(xì)胞缺氧狀態(tài)下適應(yīng)的中心調(diào)節(jié)因子，多與腫瘤細(xì)胞血管的形成、增殖及轉(zhuǎn)移有關(guān)。對(duì)于正常人而言，HIF-1α主要以解離狀態(tài)存在，導(dǎo)致其暫時(shí)喪失活性。但是，當(dāng)機(jī)體組織細(xì)胞處于低氧狀態(tài)時(shí)HIF-1α將會(huì)與HIF-1β相互結(jié)合，導(dǎo)致其表達(dá)水平迅速升高，有助于促進(jìn)新生血管的形成，加快腫瘤的轉(zhuǎn)移[12-13]。本研究中，觀察組結(jié)腸癌組織中HIF-1α與miR138陽(yáng)性率，均高于對(duì)照組（P<0.05）。提示：HIF-1α在結(jié)直腸癌組織中呈高表達(dá)，能直接參與疾病的發(fā)生、發(fā)展。研究表明：無(wú)限增殖是腫瘤細(xì)胞最重要的特征，不斷快速增殖能引起腫瘤細(xì)胞氧耗增加，而當(dāng)腫瘤細(xì)胞所需的氧超過(guò)組織供給時(shí)將會(huì)發(fā)生缺氧。此外，HIF-1α能通過(guò)多種途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥，削弱患者治療效果。miR138參與抑郁等精神活動(dòng)有關(guān)，能抑制機(jī)體免疫反應(yīng)及新生血管的形成。文獻(xiàn)報(bào)道顯示[13]：miR138能參與新生血管的形成，能抑制血管內(nèi)皮因子誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生增殖、遷移。同時(shí)，miR138能參與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，并且在腫瘤干細(xì)胞中miR138多呈高表達(dá)，會(huì)引起腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換，能提高腫瘤標(biāo)志物水平[14]。本研究中，單因素及COX回歸模型分析結(jié)果表明：結(jié)直腸癌組織中HIF-1α與miR138陽(yáng)性率與腫瘤大小、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度及浸潤(rùn)呈正相關(guān)性（P<0.05）。提示：結(jié)直腸癌組織中HIF-1α與miR138均呈高表達(dá)，并且表達(dá)水平受到的影響因素有關(guān)。為了提高患者治療效果，改善患者預(yù)后，患者手術(shù)治療過(guò)程中可加強(qiáng)HIF-1α與miR138水平監(jiān)測(cè)，動(dòng)態(tài)了解及評(píng)估患者疾病嚴(yán)重程度，善于根據(jù)監(jiān)測(cè)結(jié)果調(diào)整治療方案，使得患者的治療更具科學(xué)性、合理性[15]。

綜上所述，結(jié)直腸癌組織中HIF-1α與miR138均呈高表達(dá)，其表達(dá)水平與患者預(yù)后具有一定的相關(guān)性，加強(qiáng)患者HIF-1α與miR138水平測(cè)定能評(píng)估患者預(yù)后，值得推廣應(yīng)用。

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（收稿日期：2018-01-09）