葛會(huì)林，陶珊珊，朱祥偉，袁宏球,#，呂岱竹

1. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心 海南省熱帶果蔬產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海口 571101 2. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢 430070 3. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院，青島 266109

大量事實(shí)表明人類和所有其他生命體在環(huán)境中都暴露于多個(gè)組分的化學(xué)混合物中。環(huán)境中污染物的混合物對(duì)生物的毒性表現(xiàn)為聯(lián)合毒性[1]。人類在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中也有目的地利用這種聯(lián)合效應(yīng)，常將2種、3種或更多種不同農(nóng)藥制劑(包括助劑)配制成混合物施用。如溴氰菊脂與敵敵畏混用防治棉蚜，氯氰菊酯與滅多威混用防治棉鈴蟲[2]，多菌靈、腐霉利與嘧菌酯混配的殺菌劑防治鐵皮石斛植物病害[3]等。農(nóng)藥混用可以提高藥效、減緩病蟲害對(duì)藥劑的抗性，在化學(xué)防治有害生物方面具有重要的作用。

對(duì)于農(nóng)藥混用、復(fù)合污染等情況中混合物導(dǎo)致的加和、協(xié)同與拮抗效應(yīng)的毒性相互作用，通常基于濃度加和(concentration addition, CA)作為加和性參考模型進(jìn)行評(píng)估[4]。CA模型目前已成為混合物毒性預(yù)測(cè)與評(píng)估的金標(biāo)準(zhǔn)[5]。CA模型在笛卡爾坐標(biāo)空間可表示為圖形，對(duì)于二元混合物是直線形式的等效線，對(duì)于三元混合物則是平面三角形形式的等效面。等效線和等效面表示的優(yōu)勢(shì)在于可對(duì)不同濃度比例混合物的毒性相互作用進(jìn)行綜合圖形展示。效應(yīng)面在混合物中一般有2種表現(xiàn)形式，一種是在二元混合物中各點(diǎn)效應(yīng)不相等的面[6]，另一種是在三元混合物中各點(diǎn)效應(yīng)相等的面[7]。

為了使觀測(cè)點(diǎn)在圖形空間均勻全面分布，需要使用優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)配制混合物。直接均分射線法(EquRay)[8]和中心復(fù)合設(shè)計(jì)法[9]證明是高效的設(shè)計(jì)二元組分濃度配比的方法，可系統(tǒng)設(shè)計(jì)數(shù)個(gè)混合物點(diǎn)以全面表征二元混合物體系的濃度分布進(jìn)而全面考察二元混合物的毒性變化規(guī)律，方法簡單直觀。對(duì)于三元混合物，目前試驗(yàn)次數(shù)最少的方法是采用均勻設(shè)計(jì)方法，如劉雪等[10]應(yīng)用均勻設(shè)計(jì)法構(gòu)建了5個(gè)不同濃度配比的混合物射線，分別研究了3種除草劑及3種殺蟲劑構(gòu)成的三元混合物體系的三維等效面。均勻設(shè)計(jì)被證明是在化學(xué)物混配設(shè)計(jì)中最有效的方法[11-12]，其突出優(yōu)點(diǎn)是試驗(yàn)次數(shù)很少、普適性好，能用于三元、六元甚至十元以上混合物的設(shè)計(jì)[13]。但對(duì)于三元混合物，均勻設(shè)計(jì)的缺點(diǎn)是缺少像直接均分射線法那樣直觀的空間幾何意義。受直接均分射線法對(duì)二元組分等效線進(jìn)行均勻分割設(shè)計(jì)的啟發(fā)，本研究擬提出均分等效面設(shè)計(jì)(EESD)方法對(duì)三元組分等效面進(jìn)行均勻分割，實(shí)現(xiàn)三元組分濃度配比的優(yōu)化設(shè)計(jì)，同時(shí)顯現(xiàn)其對(duì)等效面的空間幾何意義。

化學(xué)物毒性檢測(cè)一般使用酶、細(xì)菌、細(xì)胞、藻類、魚等來表征污染物的毒性。酶抑制法相比生物檢測(cè)具有操作簡單、重復(fù)性好、測(cè)試時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)。乙酰膽堿酯酶(AChE)最常用于酶抑制法當(dāng)中，其基本原理是AChE催化底物乙酰膽堿(ATCh)水解得到膽堿，膽堿與顯色劑二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)反應(yīng)，生成黃色物質(zhì)5-硫代-2-硝基-苯甲酸，通過在412 nm檢測(cè)此黃色物質(zhì)的吸光度變化來反映酶催化反應(yīng)的變化[14]。有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥對(duì)AChE有抑制作用，兩者反應(yīng)生成共價(jià)結(jié)合的磷酰化膽堿酯酶或可水解的氨基甲?；憠A酯酶。離子液體(IL)因其低揮發(fā)性可望作為揮發(fā)性有機(jī)溶劑的替代品，文獻(xiàn)報(bào)道IL對(duì)生物也能導(dǎo)致毒性[15]，包括對(duì)AChE也有抑制作用[16]。

本研究選擇有機(jī)磷敵敵畏、氨基甲酸酯滅多威、離子液體1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽([BMIM]BF4)作為代表化學(xué)物，使用建立的EESD方法配制三元混合物，測(cè)定混合物對(duì)AChE的抑制毒性，建立混合物觀測(cè)的等效面，通過比較觀測(cè)與CA預(yù)測(cè)的等效面分析混合物毒性相互作用，最終驗(yàn)證EESD方法的實(shí)用性與有效性。

1 材料與方法 (Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

Synergy2型多功能微孔板測(cè)定儀(美國BioTek公司)，AL204型四位電子天平(梅特勒-托利多公司)，雷磁PHS-3E型pH計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，96孔透明微板(Corning 9018)。

碘化硫代乙酰膽堿(ATCI)、DTNB與電鰻AChE等3種物質(zhì)相關(guān)的具體信息見表1。DTNB、ATCI和AChE溶解于pH 6.8的磷酸鹽緩沖液(含0.025 mol·L-1KH2PO4與0.025 mol·L-1Na2HPO4·12H2O)并避光保存于4 ℃冰箱中。為溶解DTNB，參考文獻(xiàn)[14]，每克DTNB中添加0.379 g的NaHCO3。受試化合物[BMIM]BF4、滅多威(MTM)與敵敵畏(DDVP)分別溶解于pH 6.8的磷酸鹽緩沖液并避光保存于4 ℃冰箱中。

表1 實(shí)驗(yàn)中化學(xué)物質(zhì)的相關(guān)信息Table 1 Information about chemicals used in the experiment

注：乙酰膽堿酯酶(電鰻)分子結(jié)構(gòu)彩圖來源于網(wǎng)址www.rcsb.org/3d-view/1C2O/1。

Note： The molecular structure of acetylcholinesterase (Electrophoruselectricus) was from the website www.rcsb.org/3d-view/1C2O/1.

表2 單個(gè)物質(zhì)及三元(G0～G9)與二元(B1～B15)混合物抑制乙酰膽堿酯酶的劑量-效應(yīng)模型及相關(guān)參數(shù)Table 2 Dose-response model of single substances and ternary (G0-G9) and binary (B1-B15) mixtures inhibiting acetylcholinesterase and related parameters

注：pi是混合物中組分的濃度分?jǐn)?shù)；TU是以EC50計(jì)的毒性單位；c0是儲(chǔ)備液濃度；a是位置參數(shù)；b是斜率參數(shù)；R2是決定系數(shù)；RMSE是均方根誤差；EC80、EC50、EC20分別是產(chǎn)生80%、50%、20%效應(yīng)時(shí)的濃度；c0、EC80、EC50、EC20的單位均為mol·L-1；pi與TU比中的整數(shù)0表示對(duì)應(yīng)化合物不存在。

Note：piis concentration proportion of components in mixtures; TU is the toxic unit by EC50; c0is stock concentration;ais location parameter;bis slope parameter;R2is coefficient of determination; RMSE is root mean square error; EC80, EC50, and EC20are the 80%, 50%, 20%-effect concentration, respectively; all the units ofc0, EC80, EC50, and EC20are mol·L-1; Integer 0 inpiand TU ratio means that the corresponding component does not exist.

1.2 均分等效面設(shè)計(jì)與等效面構(gòu)建

對(duì)于三元混合物，本研究提出EESD法進(jìn)行混合配比。如圖1所示，在組分a、b、c的濃度軸上點(diǎn)出3個(gè)組分的EC50，A點(diǎn)坐標(biāo)為(EC50,a，0，0)，B點(diǎn)坐標(biāo)為(0，EC50,b，0)，C點(diǎn)坐標(biāo)為(0，0，EC50,c)，這3點(diǎn)兩兩連接構(gòu)成CA等效面，每兩點(diǎn)所連直線為CA等效線。將3條等效線均分為3段，各均分點(diǎn)坐標(biāo)分別為D(2EC50,a/3，EC50,b/3，0)、E(EC50,a/3，2EC50,b/3，0)、F(0，2EC50,b/3，EC50,c/3)、H(0，EC50,b/3，2EC50,c/3)、I(EC50,a/3，0，2EC50,c/3)、J(2EC50,a/3，0，EC50,c/3)。從D、E、F、H、I、J點(diǎn)分別作對(duì)面2條等效線的平行線，從而將等效面均分為9個(gè)全等三角形。

這9個(gè)小三角形的重心坐標(biāo)分別為G1(EC50,a/9，EC50,b/9，7EC50,c/9)、G2(4EC50,a/9，EC50,b/9，4EC50,c/9)、G3(2EC50,a/9，2EC50,b/9，5EC50,c/9)、G4(EC50,a/9，4EC50,b/9，4EC50,c/9)、G5(7EC50,a/9，EC50,b/9，EC50,c/9)、G6(5EC50,a/9，2EC50,b/9，2EC50,c/9)、G7(4EC50,a/9，4EC50,b/9，EC50,c/9)、G8(2EC50,a/9，5EC50,b/9，2EC50,c/9)、G9(EC50,a/9，7EC50,b/9，EC50,c/9)。將這9個(gè)小三角形的重心坐標(biāo)對(duì)應(yīng)于3個(gè)組分的9個(gè)濃度配比，設(shè)計(jì)組分毒性單位比依次為1:1:7、4:1:4、2:2:5、1:4:4、7:1:1、5:2:2、4:4:1、2:5:2、1:7:1。

另外，按照慣例設(shè)計(jì)3個(gè)組分的EC50比混合物射線，對(duì)應(yīng)于等效面ABC三角形的重心G0(EC50,a/3，EC50,b/3，EC50,c/3)，其毒性單位比為1:1:1，又稱等毒性濃度比混合物射線。這里需要指出，三元組分在三維濃度空間中的一個(gè)點(diǎn)可稱為混合物點(diǎn)，組分比例相同的點(diǎn)構(gòu)成一條混合物射線，所有的混合物射線構(gòu)成一個(gè)混合物體系[17]。

圖1 均分等效面設(shè)計(jì)法設(shè)計(jì)混合物示意圖Fig. 1 Ternary mixture design using equipartition equivalent-surface design method

得到混合物體系觀測(cè)等效點(diǎn)后，采用基于三角形的三次插值得到混合物x%效應(yīng)的觀測(cè)等效面。基本原理是以三角形為基礎(chǔ)的三次方程內(nèi)插，即先按Delaunay三角剖分算法找出內(nèi)插點(diǎn)四周的3個(gè)點(diǎn)，構(gòu)成三角形，然后使用三次方程將點(diǎn)內(nèi)插在三角形內(nèi)[18-19]。具體實(shí)現(xiàn)這個(gè)過程的Matlab代碼如下：

x=[…];

y=[…];

z=[…];

mx=min(x); %求x的最小值

Mx=max(x); %求x的最大值

my=min(y); %求y的最小值

My=max(y); %求y的最大值

Nx=50; %設(shè)置x軸插值數(shù)據(jù)點(diǎn)數(shù)

Ny=50; %設(shè)置y軸插值數(shù)據(jù)點(diǎn)數(shù)

cx=linspace(mx, Mx, Nx); %在原始x數(shù)據(jù)的最大值與最小值之間等間隔生成Nx個(gè)插值點(diǎn)

cy=linspace(my, My, Ny); %在原始y數(shù)據(jù)的最大值與最小值之間等間隔生成Ny個(gè)插值點(diǎn)

cz=griddata(x,y,z, cx, cy', 'cubic'); %調(diào)用基于三角形的三次方程進(jìn)行插值

mesh(cx, cy, cz); %繪制三維網(wǎng)格曲面

1.3 混合物設(shè)計(jì)

基于[BMIM]BF4、滅多威與敵敵畏的儲(chǔ)備液濃度(c0)與EC50，按照前述建立的EESD法進(jìn)行三者毒性單位比1:1:7、4:1:4、2:2:5、1:4:4、7:1:1、5:2:2、4:4:1、2:5:2、1:7:1設(shè)計(jì)G1～G9共9條三元混合物射線。同時(shí)按照經(jīng)典方法設(shè)置一個(gè)EC50比三元混合物射線G0。對(duì)于二元混合物，按照直接均分射線法[8]進(jìn)行毒性單位比1:5、2:4、3:3、4:2、5:1兩兩混合設(shè)計(jì)，得到B1～B15二元混合物射線，其中B3、B8、B13為等毒性濃度比混合物射線。這些混合物射線中各組分的濃度分?jǐn)?shù)見表2。

1.4 乙酰膽堿酯酶微板毒性分析

參考發(fā)光菌微板毒性分析法[20]與AChE酶抑制法[14]，建立基于AChE的微板毒性分析法[21]，具體分析程序如下。將96孔微板第12列的8個(gè)孔加入100 μL磷酸鹽緩沖液作為空白對(duì)照，其余11列加入按稀釋因子0.5設(shè)計(jì)的11個(gè)濃度梯度污染物100 μL，每個(gè)濃度8個(gè)重復(fù)，接著每孔依次加入50 μL 1 g·L-1DTNB、50 μL 1 g·L-1ATCI、50 μL 0.2 U·mL-1AChE，每孔總體積共250 μL，然后將微板送入酶標(biāo)儀于412 nm下測(cè)定0 min與15 min的OD值，全程使用空調(diào)控溫(29±1) ℃。

圖2 單個(gè)物質(zhì)抑制乙酰膽堿酯酶的劑量-效應(yīng)曲線注：□空白控制；○觀測(cè)數(shù)據(jù)點(diǎn)；—Weibull模型擬合線；┄置信區(qū)間。Fig. 2 Dose-response curves of single substances inhibiting acetylcholinesteraseNote: □ Blank control; ○ Observed data; — Weibull model fit; ┄ Confidence interval.

污染物對(duì)AChE的抑制毒性E按照公式(1)計(jì)算，得到的劑量-效應(yīng)曲線(DRC)使用公式(2)所示W(wǎng)eibull函數(shù)進(jìn)行最小二乘法擬合并計(jì)算95%的觀測(cè)置信區(qū)間[22]，得到效應(yīng)濃度如EC80、EC50、EC20等。

E=1-△ODt/△ODc

(1)

E=1-exp(-exp(a+b×log10(C)))

(2)

式中ΔODt為處理溶液0～15 min的吸光度變化值，ΔODc為對(duì)照溶液0～15 min吸光度變化值，E為效應(yīng)，C為濃度，a為位置參數(shù)，b為斜率參數(shù)。

1.5 混合物毒性預(yù)測(cè)與評(píng)估

使用公式(3)所示濃度加和(CA)模型進(jìn)行混合物毒性的預(yù)測(cè)與評(píng)估。式中n是混合物的組分?jǐn)?shù)，ci是產(chǎn)生效應(yīng)x%的混合物中組分i的濃度，ECx,i是組分i單獨(dú)引起x%效應(yīng)時(shí)的濃度。

(3)

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 單個(gè)化合物劑量-效應(yīng)曲線分析

從圖2可以看出，[BMIM]BF4、滅多威、敵敵畏對(duì)AChE抑制毒性的DRC呈良好的S型曲線，空白變異在測(cè)試中控制在了±10%以內(nèi)。DRC經(jīng)最小二乘法回歸的統(tǒng)計(jì)參數(shù)見表2，均方根誤差(RMSE)均小于0.03，決定系數(shù)(R2)均大于0.99，單個(gè)物質(zhì)DRC可用Weibull函數(shù)有效表征。擬合得到的關(guān)鍵參數(shù)如DRC位置參數(shù)a和斜率參數(shù)b、EC80(80%效應(yīng)濃度)、EC50(50%效應(yīng)濃度)、EC20(20%效應(yīng)濃度)同列于表2。從這3個(gè)效應(yīng)濃度，都可得出對(duì)AChE抑制毒性的大小順序?yàn)闇缍嗤?敵敵畏>[BMIM]BF4，3種物質(zhì)效應(yīng)濃度的差距各接近一個(gè)數(shù)量級(jí)，單個(gè)物質(zhì)EC80與EC20的差距也接近一個(gè)數(shù)量級(jí)?；旌衔飜%效應(yīng)等效面的頂點(diǎn)坐標(biāo)分別對(duì)應(yīng)單個(gè)組分的效應(yīng)濃度指標(biāo)ECx，ECx的精確性能保證構(gòu)建的混合物體系在x%效應(yīng)的CA等效面的精確性。

毒物對(duì)AChE的抑制效應(yīng)主要與乙酰膽堿、毒物、AChE三者的相互作用有關(guān)。AChE的活性位點(diǎn)有2個(gè)結(jié)構(gòu)域，即催化陰離子位點(diǎn)(catalytic anionic site, CAS)和外周陰離子位點(diǎn)(peripheral anionic site, PAS)[23]。毒物分子結(jié)構(gòu)中包括芳香基團(tuán)和可質(zhì)子化的雜原子時(shí)，兩者間滿足一定的空間取向與距離要求就可以產(chǎn)生有效的PAS作用[24]。[BMIM]BF4含咪唑五元芳雜環(huán)，其可能與AChE活性中心帶負(fù)電荷的PAS位點(diǎn)結(jié)合。敵敵畏是磷酸酯類有機(jī)磷農(nóng)藥，不同于硫代磷酯類必須經(jīng)過活化作用才能發(fā)揮藥效，可直接與AChE活性中心的CAS位點(diǎn)共價(jià)結(jié)合且抑制作用不可逆，反應(yīng)速率快。滅多威是與AChE活性位點(diǎn)以外的部位結(jié)合且結(jié)合是可逆性的，主要是通過改變酶分子的形狀來達(dá)到對(duì)AChE的抑制，為非競(jìng)爭性抑制[25]。所以，[BMIM]BF4、滅多威、敵敵畏對(duì)AChE抑制具有不同的作用模式。

2.2 基于劑量-效應(yīng)曲線的混合物毒性分析

圖3為測(cè)得的三元混合物射線G0～G9與二元混合物射線B1～B15對(duì)AChE的DRC。結(jié)果表明，所有混合物射線的DRC都可用Weibull函數(shù)有效擬合，均方根誤差(RMSE)均小于0.03，決定系數(shù)(R2)均大于0.99。擬合得到混合物的幾個(gè)效應(yīng)濃度EC80、EC50、EC20同列于表2。觀察后發(fā)現(xiàn)，二元或三元混合物的EC80、EC50、EC20都分別位于單個(gè)組分EC80、EC50、EC20的最大值與最小值之間。唯一的例外是混合物B11的EC80、EC50、EC20(表2中以*標(biāo)出)分別大于組分?jǐn)硵澄返腅C80、EC50、EC20。我們先前的研究證明CA預(yù)測(cè)的混合物某效應(yīng)濃度總是位于組分此效應(yīng)濃度的最大值與最小值之間，如果混合物某效應(yīng)濃度大于組分此效應(yīng)濃度的最大值或小于其最小值，混合物理論上將呈現(xiàn)出拮抗或協(xié)同作用[26]。所以，這表明基于CA，B11在80%、50%、20%效應(yīng)均產(chǎn)生了拮抗效應(yīng)。

以觀測(cè)DRC(指觀測(cè)點(diǎn)擬合得到的DRC)的95%置信區(qū)間作為界限，CA預(yù)測(cè)效應(yīng)大于置信區(qū)間上限判定混合物呈現(xiàn)拮抗作用，CA預(yù)測(cè)效應(yīng)小于置信區(qū)間下限判定混合物呈現(xiàn)協(xié)同作用，CA預(yù)測(cè)效應(yīng)位于置信區(qū)間上下限之間判定混合物為加和作用。另外，由于DRC擬合函數(shù)與CA模型的特性，混合物效應(yīng)趨近于0%或100%時(shí)，混合物觀測(cè)DRC與CA預(yù)測(cè)DRC將重合。

綜合來看，G0、G2～G9、B1、B3～B5、B7～B10、B12～B15混合物射線均呈現(xiàn)加和作用，其中G0、G2、G3、G5、B5、B9、B10、B13混合物射線的觀測(cè)DRC良好符合CA預(yù)測(cè)的DRC。剩下4條混合物射線產(chǎn)生了相對(duì)明顯的毒性相互作用，G1在效應(yīng)E<40%時(shí)為加和，在E>40%時(shí)為拮抗；B2在E<10%或E>40%為加和，在10%85%為加和，在15%95%為加和，在40%

圖3 三元(G0～G9)與二元(B1～B15)混合物抑制乙酰膽堿酯酶的劑量-效應(yīng)曲線注：□空白控制；○觀測(cè)數(shù)據(jù)點(diǎn)；—Weibull模型擬合線；CA預(yù)測(cè)線；┄置信區(qū)間。Fig. 3 Dose-response curves of ternary (G0-G9) and binary (B1-B15) mixtures inhibiting acetylcholinesteraseNote: □ Blank control; ○ Observed data; — Weibull model fit; CA prediction; ┄ Confidence interval.

在本研究中，所有混合物效應(yīng)低于10%的區(qū)域均為加和作用。這符合Escher等[27]提出的假設(shè)，即當(dāng)單個(gè)化合物的濃度遠(yuǎn)低于閾值效應(yīng)同時(shí)作用模式不同時(shí)，混合物將呈現(xiàn)加和毒性。我們先前研究的離子液體與重金屬對(duì)青?；【鶴67的聯(lián)合毒性也符合這個(gè)假設(shè)[28]。

觀察到一些混合物射線的CA預(yù)測(cè)DRC與觀測(cè)DRC產(chǎn)生了相交，很明顯的如B1、B2、B3混合物射線，Sun等[29]將混合物的DRC曲線穿過模型預(yù)測(cè)曲線的現(xiàn)象稱為交叉現(xiàn)象，潘永正等[30]對(duì)此進(jìn)行了評(píng)述，目前可以認(rèn)為交叉現(xiàn)象在混合物中是普遍存在的，可能與混合物中復(fù)雜的聯(lián)合作用模式有關(guān)。

2.3 基于等效面的混合物毒性相互作用分析

CA理論上預(yù)測(cè)三元混合物等效面是個(gè)平面三角形，三角形頂點(diǎn)分別位于3個(gè)組分濃度軸上的ECx濃度點(diǎn)，三角形的三條邊分別對(duì)應(yīng)組分兩兩組合的二元混合物的x%效應(yīng)的CA等效線。CA預(yù)測(cè)的G0～G9混合物射線的等效面與B1～B15混合物射線的等效線的具體方程見表3。CA模型是二元混合物等效線和三元混合物等效面的截距方程式表達(dá)。

繪制混合物完整的觀測(cè)等效面，除了需要組分濃度軸上單個(gè)組分的3個(gè)ECx點(diǎn)，還需將所有三元與二元混合物的效應(yīng)濃度ECx乘以各組分濃度分?jǐn)?shù)后所得組分濃度在空間中對(duì)應(yīng)的x%效應(yīng)的等效點(diǎn)。這樣三元混合物(G0～G9)共10個(gè)點(diǎn)，二元混合物(B1～B15)共15個(gè)點(diǎn)，3個(gè)組分共3個(gè)點(diǎn)。二元混合物所得點(diǎn)構(gòu)成二元混合物等效線上的觀測(cè)點(diǎn)，同時(shí)構(gòu)成三元混合物觀測(cè)等效面的三條邊界。

將上述共28個(gè)等效點(diǎn)采用基于三角形的三次插值得到混合物x%效應(yīng)的觀測(cè)等效面(圖4)，其中分別在[BMIM]BF4與滅多威濃度軸上數(shù)據(jù)的最大值與最小值之間等間距設(shè)置50個(gè)插值點(diǎn)。圖4中三角形為CA預(yù)測(cè)的三元混合物等效面，三角形3條邊為CA預(yù)測(cè)的組分兩兩組合的二元混合物的等效線，等效面邊界上分布的5個(gè)點(diǎn)對(duì)應(yīng)于二元混合物的觀測(cè)等效點(diǎn)。

CA等效面與三維坐標(biāo)圍成四面體，四面體內(nèi)空間定義為內(nèi)，四面體外空間定義為外。20%、50%、80%效應(yīng)的等效面將以向外遠(yuǎn)離四面體內(nèi)原點(diǎn)的方式依次間隔層疊。以CA等效面作為參考，觀測(cè)等效面向內(nèi)凹表示混合物產(chǎn)生協(xié)同作用，向外凸表示混合物產(chǎn)生拮抗作用，這個(gè)判定標(biāo)準(zhǔn)同樣適合于等效面邊界的觀測(cè)等效線。

圖4中80%與50%效應(yīng)的等效面具有較為相似的特征，[BMIM]BF4-MTM基本為加和作用。隨著DDVP濃度的增加，[BMIM]BF4-DDVP逐漸由加和轉(zhuǎn)變?yōu)檗卓?，拮抗作用最?qiáng)點(diǎn)對(duì)應(yīng)B6混合物射線DRC上的80%、50%的效應(yīng)點(diǎn)。隨著DDVP濃度的增加，MTM-DDVP逐漸從加和轉(zhuǎn)變?yōu)檗卓梗卓棺饔米顝?qiáng)點(diǎn)對(duì)應(yīng)B11混合物射線DRC上的80%與50%效應(yīng)點(diǎn)。上述結(jié)果與基于DRC的分析也是一致的。

表3 三元混合物等效面及二元混合物等效線的CA方程Table 3 CA equations of ternary mixture equivalent-surface and binary mixture isobole

注：x是[BMIM]BF4的濃度，y是滅多威的濃度，z是敵敵畏的濃度，濃度的單位是mol·L-1。

Note：xis the concentration of [BMIM]BF4;yis the concentration of methomyl;zis the concentration of dichlorvos; the unit of concentration is mol·L-1.

圖4 三元混合物在80%、50%、20%效應(yīng)的等效面Fig. 4 Ternary mixture equivalent-surface at the 80%, 50%, and 20% effects

基于等效面分析，G0及G2～G9混合物射線在80%與50%效應(yīng)水平均為加和作用。但G1混合物點(diǎn)明顯外凸，故對(duì)應(yīng)混合物呈現(xiàn)明顯拮抗效應(yīng)。DRC分析也表明G1混合物射線在80%與50%效應(yīng)點(diǎn)呈現(xiàn)拮抗作用。同時(shí)相比G0及G2～G9混合物點(diǎn)，G1混合物點(diǎn)與拮抗作用最強(qiáng)的B6、B11二元混合物點(diǎn)距離最近，2條等效線的外凸導(dǎo)致G1混合物點(diǎn)也明顯外凸，即二元混合物拮抗作用較強(qiáng)的區(qū)域?qū)е锣徑鼌^(qū)域的三元混合物點(diǎn)也產(chǎn)生了拮抗作用。由于[BMIM]BF4-DDVP及MTM-DDVP等效線的外凸，加上G1混合物點(diǎn)向外凸，導(dǎo)致在[BMIM]BF4-MTM-DDVP等效面的右上側(cè)形成了一個(gè)淺窄的鞍槽。

圖4的20%效應(yīng)的等效面中，二元混合物的觀測(cè)等效線與CA等效線均發(fā)生了不同程度的交叉。隨著DDVP濃度的增加，[BMIM]BF4-DDVP逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)檗卓梗卓棺饔米顝?qiáng)點(diǎn)對(duì)應(yīng)B6混合物射線的20%效應(yīng)點(diǎn)。B2混合物射線的20%效應(yīng)點(diǎn)在[BMIM]BF4-MTM觀測(cè)等效線上產(chǎn)生了最強(qiáng)的拮抗效應(yīng)。MTM-DDVP基本為加和作用。G1點(diǎn)類似地也有輕微的外凸，但不顯著。隨著DDVP的濃度降低，[BMIM]BF4-DDVP與MTM-DDVP等效線逐漸內(nèi)凹，導(dǎo)致等效面也整體以勺子狀內(nèi)凹，結(jié)合圖3中G0～G9的DRC上20%效應(yīng)點(diǎn)分析，三元混合物總體上呈現(xiàn)加和作用。

G0混合物射線DRC完美符合CA模型，反映在等效面上，G0作為其重心點(diǎn)，是唯一同時(shí)距離單個(gè)組分點(diǎn)即等效面頂點(diǎn)最遠(yuǎn)的點(diǎn)，理論上受三者彼此相互作用的影響也最小，所以最有可能表現(xiàn)為無毒性相互作用或加和作用。

2.4 均分等效面設(shè)計(jì)法拓展

均分等效面設(shè)計(jì)(EESD)只需知道單個(gè)化合物的EC50，不需知道其他效應(yīng)濃度水平，即可進(jìn)行混配優(yōu)化設(shè)計(jì)。三元農(nóng)藥混配中比例的選擇目前尚無統(tǒng)一的方法。如為防治鐵皮石斛炭疽病，篩選含多菌靈、腐霉利、嘧菌酯的復(fù)配殺菌劑的專利配方[3]中，三藥劑質(zhì)量比分別為3:1:4、3:1:12、3:1:1.33、6.75:2.25:1、3:1:36、14.25:4.75:1、3:1:76 (換算后數(shù)值)。若將EESD方法應(yīng)用于農(nóng)藥混配中，可以直接采用藥劑的質(zhì)量比，從而提供了一種農(nóng)藥混配的優(yōu)化設(shè)計(jì)方法。EESD對(duì)于三元農(nóng)藥或三元藥物的聯(lián)合效應(yīng)研究具有參考意義。

按照劉雪等[10]的均勻設(shè)計(jì)方案，將本研究中的[BMIM]BF4、MTM、DDVP三個(gè)組分的5個(gè)效應(yīng)濃度(EC10、EC20、EC30、EC40、EC50)作為因素水平，采用U5(54)均勻表中的第1、2、3列設(shè)計(jì)了5個(gè)虛擬的混合物，基于CA模型得到這5個(gè)混合物在50%等效面上對(duì)應(yīng)的點(diǎn)(見圖5中黑點(diǎn))。以最簡單的四均分等效面設(shè)計(jì)作為對(duì)比，其對(duì)應(yīng)的4個(gè)重心點(diǎn)見圖5中紅圈?？梢钥闯?，對(duì)于等效面，EESD點(diǎn)的分布更為均勻；點(diǎn)的覆蓋范圍也更大一些，這對(duì)于繪制完整的等效面是至關(guān)重要的。所以，EESD能最大程度地均勻覆蓋混合物等效面，且具有明確的空間幾何意義。但對(duì)于四元以上混合物，均勻設(shè)計(jì)是為數(shù)不多能用于混合物設(shè)計(jì)的方法。

試驗(yàn)設(shè)計(jì)是在因素可取值的區(qū)域內(nèi)，最有效地采樣試驗(yàn)點(diǎn)，達(dá)到采樣點(diǎn)具有代表性以及采樣點(diǎn)數(shù)在可接受的范圍內(nèi)等目的。EESD即為解決如何在等效面對(duì)應(yīng)的三角形平面內(nèi)高效而有代表性地采樣試驗(yàn)點(diǎn)為目的。以析因試驗(yàn)設(shè)計(jì)作為對(duì)比，對(duì)于n個(gè)試驗(yàn)因素(化合物)，每個(gè)因素m個(gè)水平(濃度)，需安排的實(shí)驗(yàn)次數(shù)為mn次。如Charles等[31]應(yīng)用雌激素受體試驗(yàn)研究3個(gè)組分的混合物毒性，其中每個(gè)化合物都以4個(gè)濃度水平進(jìn)行全因子設(shè)計(jì)，需完成64次實(shí)驗(yàn)。Narotsky等[32]用5×5×5設(shè)計(jì)研究了乙炔化三氯、鄰苯二甲酸二乙基乙酯和七氯每個(gè)化合物5個(gè)劑量水平的混合物毒性，需設(shè)計(jì)125次試驗(yàn)。而按照本研究中的EESD，這2個(gè)例子分別需要25次與36次試驗(yàn)。這里的相同點(diǎn)是試驗(yàn)次數(shù)都以指數(shù)冪形式增加，不同點(diǎn)是析因設(shè)計(jì)的指數(shù)為3，EESD的指數(shù)為2。

所以本質(zhì)上，EESD是一種降維設(shè)計(jì)方法，將廣闊的三維濃度空間壓縮至二維平面進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)。隨著等效線分割點(diǎn)數(shù)增加時(shí)，如設(shè)計(jì)1、2、3、4、5個(gè)均分點(diǎn)時(shí)，EESD的比例總個(gè)數(shù)分別為4、9、16、25、36個(gè)，試驗(yàn)次數(shù)增加仍然很快，所以應(yīng)根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的均分?jǐn)?shù)。

設(shè)組分?jǐn)?shù)為n(n=3)，等效線均分點(diǎn)數(shù)為m(m≥1且為整數(shù))，EESD法的重心坐標(biāo)為(EC50,a×ea/(n×(m+1))，EC50,b×eb/(n×(m+1))，EC50,c×ec/(n×(m+1)))，

其中ea、eb、ec為EESD設(shè)計(jì)的TU比中的元素。歸納后得到EESD法構(gòu)造TU比的幾條規(guī)則：

(1)構(gòu)造的比例總個(gè)數(shù)或等效面均分?jǐn)?shù)目Sm,n=(m+1)^(n-1)；

(2)每組比例中元素均為正整數(shù)，且元素之和Se=ea+eb+ec=n×(m+1)；

(3)每組比例中元素e≤n×(m+1)且e≠j×n，其中j=1,…,m。

根據(jù)該規(guī)則進(jìn)行排列組合可以完全唯一地構(gòu)造出4、9、16、25、36均分等效面設(shè)計(jì)的比例，具體數(shù)值見表4。但該規(guī)則推廣到更一般的情況還需研究與證明。

圖5 均勻設(shè)計(jì)(黑點(diǎn))與均分等效面設(shè)計(jì)(紅圈)的三元混合物濃度點(diǎn)在等效面上的分布圖Fig. 5 Distribution diagram of ternary mixture concentration points at the equivalent-surface based on uniform design (black dots) and equipartition equivalent-surface design (red circles)

mSm,nSeEESD設(shè)計(jì)的毒性單位比例Toxic unit ratio designed by EESD1461:1:4、4:1:1、2:2:2、1:4:12991:1:7、4:1:4、2:2:5、1:4:4、7:1:1、5:2:2、4:4:1、2:5:2、1:7:1316121:1:10、4:1:7、2:2:8、1:4:7、7:1:4、5:2:5、4:4:4、2:5:5、1:7:4、10:1:1、8:2:2、7:4:1、5:5:2、4:7:1、2:8:2、1:10:1425151:1:13、4:1:10、2:2:11、1:4:10、7:1:7、5:2:8、4:4:7、2:5:8、1:7:7、10:1:4、8:2:5、7:4:4、5:5:5、4:7:4、2:8:5、1:10:4、13:1:1、11:2:2、10:4:1、8:5:2、7:7:1、5:8:2、4:10:1、2:11:2、1:13:1536181:1:16、4:1:13、2:2:14、1:4:13、7:1:10、5:2:11、4:4:10、2:5:11、1:7:10、10:1:7、8:2:8、7:4:7、5:5:8、4:7:7、2:8:8、1:10:7、13:1:4、11:2:5、10:4:4、8:5:5、7:7:4、5:8:5、4:10:4、2:11:5、1:13:4、16:1:1、14:2:2、13:4:1、11:5:2、10:7:1、8:8:2、7:10:1、5:11:2、4:13:1、2:14:2、1:16:1

注：m為等效線均分點(diǎn)數(shù)，Sm,n為組分?jǐn)?shù)為n及等效線均分點(diǎn)數(shù)為m的等效面的均分?jǐn)?shù)目，Se為每組比例中元素之和。

Note：mis the equipartition number of isobole;Sm,nis the equipartition number of equivalent-surface with component numbernand isobole equipartition numberm;Seis the sum of the elements in each set of ratios.

致謝：感謝中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所賈瑞宗博士在文章修改中給予的幫助。感謝審稿人對(duì)提高文章質(zhì)量提出的有建設(shè)性的修改意見。