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        QuEChERS-HPLC-MS/MS法分析丙硫菌唑及其代謝物在小麥和土壤中的殘留

        2018-11-28 06:52:22閆小龍楊邦保余向陽
        食品科學(xué) 2018年22期
        關(guān)鍵詞:丙硫菌唑半衰期殘留量

        孫 星,閆小龍,楊邦保,丁 悅,余向陽*

        (農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全控制技術(shù)與標(biāo)準(zhǔn)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室(南京),江蘇 南京 210014)

        丙硫菌唑是一種新型廣譜三唑硫酮類殺菌劑,由拜耳公司開發(fā)[1],主要用于防治由子囊菌、擔(dān)子菌以及半知菌引起的病害[2],其作用機(jī)理是抑制真菌中甾醇的前體——羊毛甾醇或2,4-亞甲基二氫羊毛甾醇14位上的脫甲基化作用,即脫甲基化抑制劑[3]。丙硫菌唑具有毒性低、無致畸、致突變性、對胚胎無毒性、對人和環(huán)境安全等特點(diǎn),具有很好的內(nèi)吸活性,可以優(yōu)異的保護(hù)、治療和根除活性,并且持效期長,具有廣譜的殺菌活性[4-5]。2004年上市以來,丙硫菌唑在谷類、麥類、豆類農(nóng)產(chǎn)品中廣泛應(yīng)用,幾乎對麥類所有病害,均有很好的防效[6-7]。丙硫菌唑在作物和土壤中的主要代謝物為其脫硫產(chǎn)物硫酮菌唑[8]。目前關(guān)于丙硫菌唑的研究主要集中在毒力測定[9-10]、合成工藝[4-5,11-13]、田間防治效果[7,14]及含量檢測分析[15-18]、土壤中的殘留消解及轉(zhuǎn)化研究以及對其在土壤中的降解規(guī)律進(jìn)行闡述[8]。鮮見丙硫菌唑在小麥中殘留以及降解動(dòng)態(tài)的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用QuEChERS樣品前處理方法結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,HPLCMS/MS)檢測技術(shù),研究丙硫菌唑及其代謝物在小麥和土壤中的殘留降解動(dòng)態(tài)和最終殘留量,為丙硫菌唑在小麥上的施用劑量和安全間隔期提供科學(xué)依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        98.5 %丙硫菌唑標(biāo)準(zhǔn)品、99%硫酮菌唑標(biāo)準(zhǔn)品 德國Dr. Ehrenstorfer公司;乙腈(分析純) 天津科密歐化學(xué)試劑有限公司;甲醇(色譜級(jí)) 德國默克化工技術(shù)有限公司;十八烷基鍵合硅膠吸附劑(C18) 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司;40%丙硫·戊唑醇懸浮劑(其中丙硫菌唑含量為20%) 溧陽中南化工有限公司。

        1.2 儀器與設(shè)備

        1290-6470A液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國Agilent公司;R10.v.v食品切碎攪拌機(jī) 法國Robot Coupe公司;QL-901渦流混合器 江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠;Talboys數(shù)顯型多管式旋渦混合器 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司;AL204十萬分之一電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;JJ-200百分之一電子天平常州雙杰電子有限公司。

        1.3 方法

        1.3.1 田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)

        40%丙硫·戊唑醇懸浮劑在小麥植株和土壤中降解動(dòng)態(tài)和最終殘留試驗(yàn)按NY/T 788—2004《農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》執(zhí)行[19],設(shè)有空白對照區(qū)、低劑量處理區(qū)、高劑量處理區(qū)和消解動(dòng)態(tài)處理區(qū)。降解動(dòng)態(tài)試驗(yàn):分別與小麥試驗(yàn)地及空白土壤地均勻施藥。施藥劑量為制劑量75 g/667 m2(450 g a.i./hm2),施藥后2 h,1、3、7、10、14、21、30 d采樣。植株樣本的采集:隨機(jī)在試驗(yàn)小區(qū)內(nèi)剪取地表以上的全株(去根)1 kg,切碎、混勻后采用四分法留樣500 g,裝入樣本容器中,黏好標(biāo)簽,備用。土壤樣本的采集:隨機(jī)取點(diǎn)5~10 個(gè),用土鉆采集0~10 cm的土壤2 kg,除去土壤中的碎石、雜草和植物根莖等雜物,在盆中混合均勻后采用四分法留樣500 g,裝入樣本容器中,黏好標(biāo)簽,備用。最終殘留試驗(yàn):分別設(shè)50 g/667 m2(300 g a.i./hm2)與75 g/667 m2(450 g a.i./hm2)低高2 個(gè)施藥劑量,施藥2~3 次,施藥間隔期7 d。距離最后1 次施藥的間隔時(shí)間28、35、42 d采樣。植株樣本采集:用隨機(jī)方式在試驗(yàn)小區(qū)中剪取土表以上的全株1 kg,切碎、混勻后采用四分法留樣500 g,裝入樣本容器中包扎妥當(dāng),黏好標(biāo)簽,備用。小麥籽粒樣本采集:用隨機(jī)方式在小區(qū)中剪取稻穗2 kg,裝入樣本袋中包扎妥當(dāng),黏好標(biāo)簽,備用。土壤樣本采集:隨機(jī)取點(diǎn)5~10 個(gè),采用土鉆采集0~15 cm的土壤1~2 kg,除去土壤中的碎石、雜草和植物根莖等雜物,裝入樣本容器中包扎妥當(dāng),黏好標(biāo)簽,備用。

        1.3.2 樣品提取凈化

        稱取5.0 g樣品于50 mL離心管中,加20 mL乙腈,數(shù)顯型多管式旋渦混合器振蕩20 min,經(jīng)5 000 r/min離心,取1 mL上清液轉(zhuǎn)移至5 mL離心管中,氮吹至干,2 mL色譜甲醇定容,加入100 mg無水硫酸鎂和50 mg C18填料,旋渦振蕩,5 000 r/min離心,取上清液于進(jìn)樣瓶中待測。

        1.3.3 HPLC-MS/MS檢測條件

        色譜條件:Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(2.1 mm×50 mm,1.8 μm);柱溫35 ℃;進(jìn)樣體積2.0 μL;流動(dòng)相及洗脫程序見表1。

        表1 流動(dòng)相梯度洗脫條件Table 1 Eluent gradient conditions

        質(zhì)譜條件:電噴霧離子源;多反應(yīng)監(jiān)測正負(fù)離子掃描;毛細(xì)管電壓3 500 V;干燥氣溫度300 ℃;干燥氣流速6 L/min;噴霧器壓力25 psi;鞘流氣溫度250 ℃;鞘流氣流速5 L/min;采集參數(shù)見表2。

        表2 丙硫菌唑及脫硫代謝物硫酮菌唑的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 MS parameters for determination of prothioconazole and prothioconazole-desthio

        HPLC-MS/MS測定采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量,組分含量按公式(1)計(jì)算:

        式中:Xi為試樣中北側(cè)組分含量/(mg/kg);Ci為從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線得到的試樣溶液中被測組分的質(zhì)量濃度/(mg/L);M為被測樣品質(zhì)量/g;Vm為試樣提取液的總體積/mL;V1為試樣移取提取液的體積/mL;V2為試樣定容體積/mL。

        1.3.4 降解半衰期的計(jì)算

        丙硫菌唑及硫酮菌唑消解反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程按公式(2)計(jì)算,降解半衰期按公式(3)計(jì)算[20]:

        式中:Ct為t時(shí)刻丙硫菌唑及硫酮菌唑的殘留含量/(mg/kg);C0為丙硫菌唑及硫酮菌唑的初始質(zhì)量濃度/(mg/L);k為降解速率常數(shù)/d-1;t1/2為降解半衰期/d。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 HPLC-MS/MS條件優(yōu)化

        采用甲醇與水的梯度洗脫為HPLC-MS/MS的流動(dòng)相,正負(fù)離子掃描反應(yīng)離子監(jiān)測模式檢測丙硫菌唑與硫酮菌唑,保證丙硫菌唑與硫酮菌唑有較高的靈敏度和準(zhǔn)確度。進(jìn)入一級(jí)質(zhì)譜后,在正離子檢測方式下,硫酮菌唑產(chǎn)生穩(wěn)定的[M+H]+分子離子峰,即m/z 312.1;在負(fù)離子檢測方式下,丙硫菌唑產(chǎn)生穩(wěn)定的[M-H]-準(zhǔn)分子離子峰,即m/z 342.0。進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描,得到硫酮菌唑的特征碎片離子為m/z 70.1和m/z 124.9;丙硫菌唑的特征碎片離子為m/z 99.9和m/z 125.0。分別選取m/z 70.1和m/z 99.9為硫酮菌唑和丙硫菌唑的定量離子,m/z 124.9和m/z 125.0為硫酮菌唑和丙硫菌唑的定性離子。

        2.2 前處理方法優(yōu)化

        圖1 4 種凈化方式下丙硫菌唑(A)及硫酮菌唑(B)在小麥籽粒、小麥植株及土壤中的回收率情況Fig. 1 Recoveries of prothioconazole (A) and prothioconazole-desthio (B)in wheat grains, wheat straw and soil with four purification methods

        乙腈是農(nóng)藥殘留檢測方面常用提取溶劑,難以提取農(nóng)作物中糖、蛋白質(zhì)類化合物,對絕大多數(shù)農(nóng)藥有較高的回收率[21],因此選擇乙腈作為本實(shí)驗(yàn)提取試劑,以確保目標(biāo)化合物的有效提取并使提取液中的干擾物較少,本實(shí)驗(yàn)借鑒QuEChERS凈化方法[22-29],比較了PSA、NH2、C18及GCB 4 種填料在凈化上的效果,如圖1所示,PSA、NH2及GCB填料雖然除雜效果好,但對丙硫菌唑吸附明顯,影響回收率,C18除雜效果稍弱,但不影響回收率。為保持良好的添加回收率,綜合考慮本實(shí)驗(yàn)使用100 mg無水硫酸鎂和50 mg C18作為QuEChERS處理的吸附劑。

        2.3 方法驗(yàn)證

        2.3.1 線性范圍及檢出限結(jié)果

        使用空白溶劑,配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶液1、2、5、10、20、50、100 μg/L和200 μg/L,在1.3.3節(jié)液相色譜-質(zhì)譜條件下測定,以丙硫菌唑和硫酮菌唑標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。其中,丙硫菌唑線性回歸方程為y=83 815x-17.443,r2=0.996 8;硫酮菌唑線性回歸方程為y=94 182x-6.143 3,r2=0.999 8。峰面積與溶液質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系。以3 倍信噪比為儀器檢出限,丙硫菌唑及其代謝物的檢出限均為2×10-3ng。

        2.3.2 方法準(zhǔn)確度、精密度和靈敏度測定結(jié)果

        表3 丙硫菌唑及硫酮菌唑在小麥籽粒、小麥植株及土壤中的添加回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)Table 3 Recoveries and relative standard deviations (RSDs) for prothioconazole and prothioconazole-desthio in wheat grains, wheat straw and soil (n= 5)

        如表3所示,在0.02、0.1 mg/kg和0.5 mg/kg 3 個(gè)添加水平下,丙硫菌唑在小麥籽粒、小麥植株和土壤中回收率分別為87.3%~103.0%、93.6%~100.3%和85.0%~100.5%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.5%~8.4%、9.3%~10.1%和8.9%~10.3%;硫酮菌唑在小麥籽粒、小麥植株和土壤中回收率分別為93.2%~109.9%、92.7%~101.9%和81.7%~95.6%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.4%~8.4%、4.2%~7.6%和4.0%~8.3%。各樣本的添加回收率和變異系數(shù)在允許范圍內(nèi),符合NY/T 788—2004的要求??瞻滋砑拥湫蛨D譜見圖2。

        圖2 丙硫菌唑及硫酮菌唑在小麥籽粒、小麥植株及土壤中的空白與添加回收樣品HPLC-MS/MS圖Fig. 2 HPLC-MS/MS pro fi les of prothioconazole and prothioconazoledesthio in wheat grains, wheat straw and soil

        2.4 丙硫菌唑及其代謝物硫酮菌唑消解動(dòng)態(tài)結(jié)果

        圖3 丙硫菌唑及硫酮菌唑在小麥植株(A)及土壤(B)的消解動(dòng)態(tài)曲線Fig. 3 Dynamic curves of prothioconazole and prothioconazole-desthio residue in wheat straw (A) and soil (B)

        江蘇、河南和北京三地中丙硫菌唑在植株的原始沉積量分別為0.182、0.148 mg/kg和0.142 mg/kg,在土壤中的原始沉積量分別為0.086、0.025 mg/kg和0.044 mg/kg,其殘留量與施藥后間隔時(shí)間呈指數(shù)關(guān)系,降解動(dòng)態(tài)符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程回歸曲線。如圖3所示,植株消解動(dòng)力學(xué)方程:江蘇試驗(yàn)點(diǎn)為Ct=0.184 7e-0.159t,R2=0.999 0,半衰期t1/2=4.4 d;河南試驗(yàn)點(diǎn)為Ct=0.123 7e-0.395t,R2=0.824 2,半衰期t1/2=1.8 d;北京試驗(yàn)點(diǎn)為Ct=0.202 6e-0.211t,R2=0.872 6,半衰期t1/2=3.3 d。河南土壤中殘留量的檢出值少于3 個(gè),未作回歸曲線;江蘇和北京土壤中消解動(dòng)力學(xué)方程:江蘇試驗(yàn)點(diǎn)為Ct=0.044 7e-0.037t,R2=0.555 1,半衰期t1/2=18.7 d;北京試驗(yàn)點(diǎn)為Ct=0.079 8e-0.050t,R2=0.740 1,半衰期t1/2=13.9 d。

        江蘇、河南和北京三地中硫酮菌唑在植株的原始沉積量分別為0.599、0.361 mg/kg和0.566 mg/kg,在土壤中的原始沉積量分別為0.041、0.014 mg/kg和0.013 mg/kg,植株中殘留量與施藥后間隔時(shí)間呈指數(shù)關(guān)系,降解動(dòng)態(tài)符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程回歸曲線。如圖3B2所示,土壤中殘留量與施藥后間隔時(shí)間不呈指數(shù)關(guān)系,這可能與土壤環(huán)境更復(fù)雜有關(guān),未作回歸曲線。植株消解動(dòng)力學(xué)方程:江蘇試驗(yàn)點(diǎn)為Ct=0.438 6e-0.111t,R2=0.709 2,半衰期t1/2=6.2 d;河南試驗(yàn)點(diǎn)為Ct=0.484 4e-0.236t,R2=0.934 2,半衰期t1/2=2.9 d;北京試驗(yàn)點(diǎn)為Ct=0.365 1e-0.115t,R2=0.738 1,半衰期t1/2=6.0 d。

        2.5 丙硫菌唑及其代謝物硫酮菌唑最終殘留測定結(jié)果

        如表4所示,小麥?zhǔn)斋@時(shí)采收,在一年三地小麥籽粒樣品中均未檢出丙硫菌唑和硫酮菌唑的殘留,丙硫菌唑在小麥植株中殘留量為<0.02~0.225 mg/kg,在土壤中殘留量為<0.02~0.033 mg/kg;硫酮菌唑在小麥植株中殘留量為<0.02~0.282 mg/kg,在土壤中殘留量為<0.02~0.049 mg/kg。

        表4 丙硫菌唑及硫酮菌唑在小麥籽粒、小麥植株及土壤中的殘留量Table 4 Residues of prothioconazole and prothioconazole-desthio in wheat grains, wheat straw and soil

        3 討 論

        本研究采用QuEChERS前處理方法結(jié)合HPLC-MS/MS檢測技術(shù),定性、定量研究丙硫菌唑及其代謝物硫酮菌唑在小麥籽粒、小麥植株和土壤中的殘留降解動(dòng)態(tài)和最終殘留量。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)河南地區(qū)丙硫菌唑與硫酮菌唑的半衰期低于江蘇和北京兩地,江蘇和北京這兩地在2016年平均日照時(shí)間約為250 h,而河南地區(qū)2016年的平均日照時(shí)間在350 h以上,這可能是隨著日照時(shí)間的延長從而加速了丙硫菌唑與硫酮菌唑的降解。植株動(dòng)態(tài)樣品中丙硫菌唑的原始沉積量均小于硫酮菌唑的原始沉積量,丙硫菌唑的半衰期比硫酮菌唑半衰期短。相同間隔期的終殘樣品中丙硫菌唑檢出值均小于硫酮菌唑的檢出值,說明在自然環(huán)境中丙硫菌唑很快轉(zhuǎn)化為硫酮菌唑。GB 2763—2016《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[30]中丙硫菌唑的殘留定義為丙硫菌唑脫硫代謝物(硫酮菌唑),以丙硫菌唑計(jì),小麥中的臨時(shí)限量標(biāo)準(zhǔn)為0.1 mg/kg;食品法典委員會(huì)中丙硫菌唑的殘留定義為硫酮菌唑?,F(xiàn)有定義中均未涉及丙硫菌唑的殘留,本實(shí)驗(yàn)同時(shí)研究丙硫菌唑和硫酮菌唑的消解趨勢,結(jié)果表明,丙硫菌唑很快轉(zhuǎn)化為硫酮菌唑,硫酮菌唑殘效期長于丙硫菌唑殘效期。在三地的小麥籽粒中丙硫菌唑及其代謝物硫酮菌唑均未檢出,但植株中硫酮菌唑檢出值均高于丙硫菌唑,因此,與丙硫菌唑相比,硫酮菌唑在小麥中的殘留量更需引起人們的關(guān)注。

        4 結(jié) 論

        丙硫菌唑在小麥植株和土壤中降解動(dòng)態(tài)符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)指數(shù)模型,硫酮菌唑在小麥植株中降解動(dòng)態(tài)符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)指數(shù)模型,土壤中降解動(dòng)態(tài)不符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)指數(shù)模型。丙硫菌唑在小麥植株中半衰期為1.8~4.4 d,土壤中的半衰期分別為13.9~18.7 d;硫酮菌唑在小麥植株中半衰期為2.9~6.2 d。40%丙硫·戊唑醇懸浮劑以300 g a.i./hm2推薦劑量及450 g a.i./hm2劑量施藥時(shí),丙硫菌唑及其代謝物硫酮菌唑在小麥籽粒中均未檢出。表明在推薦使用劑量條件下,在小麥上施用丙硫菌唑是安全的。

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