李立強 王聰 谷涌泉 張建 李建新

兩腎一夾型腎血管性高血壓大鼠模型，由于其操作相對簡單、手術(shù)創(chuàng)傷小、造模成功率高，且能產(chǎn)生顯著、穩(wěn)定的高血壓等優(yōu)點，在高血壓及腎臟疾病的基礎(chǔ)研究領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。本文通過使用新型的Vevo 2100超聲儀，定量分析兩腎一夾型腎血管性高血壓大鼠模型造模前后主動脈及腎動脈血流參數(shù)，為造模是否成功提供更全面的依據(jù)。

材料與方法

一、實驗動物

15只健康成年雄性SPF級SD大鼠（生產(chǎn)許可證編號：SCXK（京）2016?0006），體質(zhì)量350～400 g，購自首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院實驗動物中心（SYXK（京）2015?0016），均以瓶裝飲用水及常規(guī)固體飼料飼養(yǎng)，于動物房適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后進行實驗。動物實驗過程依據(jù)3R原則對實驗動物給予人道關(guān)懷，且所有操作均符合中華人民共和國《實驗動物管理條例》。實驗通過我院倫理委員會審查（編號201401007）。

二、試劑與儀器

Vevo超高分辨率小動物超聲實時分子影像系統(tǒng)配備MS?250探頭（加拿大Visual Sonics公司）；常規(guī)手術(shù)器械（上海金鐘器械廠）；1/0手術(shù)絲線；鈦合金血管夾及施夾器（美國Auto Suture公司）；0.23 mm胰島素針頭（諾和諾德公司）；10%水合氯醛（首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院藥房自制）。

三、模型制作

術(shù)前12 h禁食，以10%水合氯醛按照0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉后，腹部使用脫毛膏備皮。碘伏消毒，酒精脫碘。腹部正中切口，逐層切開進入腹腔，取出腸管以生理鹽水紗布包裹，游離左腎靜脈顯露左腎動脈。在左腎主動脈主干近中點處，與腎動脈平行襯以直徑為0.23 mm的胰島素針頭，用施夾器夾持鈦合金血管夾，水平位鉗夾腎動脈中段及胰島素針。釋放鈦夾后，小心取出胰島素針頭。腸管推送回腹腔，逐層縫合腹膜、腹白線及皮膚。

四、超聲檢查及觀察指標

造模前后，分別使用Vevo 2100超高分辨率小動物超聲實時分子影像系統(tǒng)配備MS?250探頭行血管超聲檢查。大鼠仰臥位，探頭于中下腹，二維超聲顯示大鼠腹主動脈以及左右兩側(cè)的腎動脈主干，疊加彩色多普勒，以角度＜60°將取樣容積分別置于近腎動脈開口處腹主動脈以及左側(cè)腎動脈狹窄處及遠端，觀察彩色血流顯像并記錄血流流速參數(shù)及波形。依次讀取3～5個血流頻譜對應(yīng)的血流動力學(xué)參數(shù)，取測量數(shù)據(jù)的平均值。記錄腎動脈狹窄處及遠端和近腎動脈開口處主動脈的收縮期峰值流速（PSV）和波形，以及由此產(chǎn)生的腎主動脈比值（RAR）。

五、尾動脈收縮壓變化

造模前與造模14 d后于大鼠清醒狀態(tài)測量尾動脈收縮壓，將大鼠置于40℃環(huán)境下，預(yù)熱5 min后大鼠于舒適位置固定，加壓袖口引入圍繞于大鼠尾根部，給予充氣加壓后緩慢下降壓力并記錄血壓。每只鼠連續(xù)測量收縮期血壓3次，每次間隔60 s以上，取3次記錄的平均值。

六、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、造模大鼠腎動脈彩色多普勒超聲參數(shù)變化

造模前腎動脈狹窄處PSV為（383.79±53.20）mm/s，造模后PSV為（1 061.80±170.42）mm/s，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-16.764，P＜0.001）；造模前近腎動脈開口處主動脈PSV為（385.25±39.81） mm/s，造模后PSV為（379.63±49.81） mm/s，兩者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.346，P=0.735）；造模前腎動脈遠端PSV為（400.10±26.70） mm/s，造模后PSV為（226.51±22.49）mm/s，兩者比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=42.457，P＜0.001）；造模前RAR為1.00±0.13，造模后RAR為2.80±0.29，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-23.632，P＜0.001），見圖1。

二、造模大鼠尾動脈收縮壓變化

造模前尾動脈收縮壓為（117±10） mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）， 造模后14 d上升至（150±9）mm Hg，造模前、后比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-15.515，P＜0.001）。且15只大鼠收縮壓升高均在20 mm Hg以上，高血壓模型建立成功，見圖2。

討 論

腎血管性高血壓的動物模型最早源于Goldblatt于1934年進行的經(jīng)典實驗，實驗證實使用血管夾制造狗的一側(cè)腎動脈狹窄之后，能夠產(chǎn)生持續(xù)并且穩(wěn)定的高血壓[1]。在此基礎(chǔ)上，醫(yī)學(xué)研究者如今已廣泛使用SD或Wistar大鼠建立腎血管性高血壓的動物模型。經(jīng)過數(shù)十年的發(fā)展，當前的造模方式包括兩腎一夾法、一腎一夾法、兩腎兩夾法，或者通過行腹主動脈縮窄術(shù)造成雙側(cè)腎臟低灌注誘導(dǎo)高血壓動物模型[2]。兩腎一夾法是指制造一側(cè)腎動脈狹窄而對側(cè)腎動脈不做處理，是研究腎血管性高血壓最常用的模型。其優(yōu)點是操作相對簡單、手術(shù)創(chuàng)傷小，動物發(fā)生急性心力衰竭、腎衰的可能性較小，造模成功率高，并且術(shù)后血壓升高明顯、穩(wěn)定，還有機理單純，以腎素?血管緊張素?醛固酮系統(tǒng)（RAAS）激活為主。RAAS被廣泛認可和研究，腎動脈狹窄致腎臟血流量減少，腎臟缺血，激活了RAAS，醛固酮作用于腎臟髓質(zhì)導(dǎo)致水鈉潴留，血壓上升。同時醛固酮也在介導(dǎo)腎臟、心、腦血管損傷的過程中發(fā)揮著作用[3]。另一方面通過激活血管平滑肌AT1受體引起血管收縮，從而產(chǎn)生繼發(fā)性高血壓[4]。

圖2 造模前后大鼠尾動脈收縮壓變化

以往文獻中，對于兩腎一夾法造模成功的鑒定方法，主要是通過測量造模后的尾動脈收縮壓較術(shù)前升高的程度來評價，或是通過腎臟病理學(xué)檢查觀察腎臟缺血性改變[5?7]。既往文獻中因造模中制造腎動脈狹窄的方法不同，其血壓開始升高、達到峰值的時間及血壓升高的程度也有所差異。我們的實驗于造模前及造模后14 d對動物模型進行血壓測量，其尾動脈收縮壓顯著升高，且每只大鼠個體的收縮壓均上升20 mm Hg以上，高血壓模型造模成功。但是，造模術(shù)后收縮壓何時上升，上升的程度變異較大，與大鼠個體差異、環(huán)境、造模方法（絲線、血管夾等）相關(guān)，因此尚無一個統(tǒng)一定量的標準；腎臟病理學(xué)的檢查，必須處死動物取材才能進行，不能實現(xiàn)動態(tài)觀察，因此會延長實驗周期甚至造成實驗失敗，增加實驗成本。

血管造影成像技術(shù)仍是評價血管病變的“金標準”，但血管造影是有創(chuàng)檢查，行血管造影可能引起造影劑腎病，對腎血管性高血壓后繼發(fā)的腎臟缺血的病理改變造成影響[8]。由于上述動脈造影術(shù)的局限性，我們采用Vevo小動物超聲系統(tǒng)評價腎動脈狹窄動物模型及狹窄程度。我們使用的高頻超聲儀器專為實驗用小動物設(shè)計，要求麻醉后動物保持絕對的安靜狀態(tài)，動物固定臺移動來耐心尋找合適的切入角度和切入面。目前，小動物超聲技術(shù)主要應(yīng)用于心力衰竭、心肌梗死、動脈損傷等疾病的動物實驗研究，在心腔及瓣膜成像以及血流動力學(xué)頻譜的清晰度優(yōu)于臨床使用的超聲設(shè)備，可以測不同靶血管的血流速度及波形頻譜，提供心血管方面圖像及參數(shù)[9?11]。使用Vevo 2100小動物超聲技術(shù)，配備超高分辨率的MS?250探頭，造模后檢查大鼠模型建立時制造的腎動脈狹窄處血流情況以及腎動脈開口處主動脈流速，可大大增加兩腎一夾型腎血管性高血壓大鼠模型的成功率。本研究中造模后腎動脈狹窄處及遠端PSV、RAR與造模前比較差異顯著。同時，我們也會檢查近腎門處遠端腎動脈的流速和波形，遠端出現(xiàn)收縮期峰值流速顯著下降和低搏動的波形改變，也證明了該兩腎一夾型腎動脈狹窄大鼠模型的局部腎動脈狹窄程度為重度狹窄，存在血流動力學(xué)改變和遠端腎臟實質(zhì)的血流低灌注。對于使用類似于Vevo高分辨率小動物超聲系統(tǒng)評估正常大鼠腎動脈的血流參數(shù)既往有相關(guān)報道，但尚無針對兩腎一夾法腎血管性高血壓動物模型血流參數(shù)的報道[12]。

綜上所述，腎血管性高血壓動物模型對研究腎動脈狹窄、缺血性腎病所致高血壓的發(fā)生機制和病理生理、藥物治療效果等是一種不可缺少的研究工具。Vevo 2100彩色多普勒超聲能快速評價兩腎一夾型腎血管性高血壓大鼠模型是否成功建立，并且能夠動態(tài)觀察，準確性高，值得在動物實驗中推廣。