李 翠，趙明剛，趙 樂(lè)，王曉巖，王 翔

(1.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心;2.檢驗(yàn)科，陜西 西安 710061)

近年來(lái)，出生缺陷已成為全球性的人口健康問(wèn)題[1-2]。在我國(guó)，出生缺陷總發(fā)生率約為5.6%，且每年新增出生缺陷數(shù)高達(dá)90萬(wàn)例[3]。出生缺陷已嚴(yán)重影響人口素質(zhì)和群體健康水平[4]。據(jù)報(bào)道，目前70%的出生缺陷由于遺傳因素所致，其中染色體異常較為常見(jiàn)。在產(chǎn)前診斷染色體異常中，最常見(jiàn)的是21染色體、18染色體、13染色體及性染色體的非整倍體，占染色體數(shù)目異常的80%以上[5]。由于染色體疾病目前并無(wú)有效的治療方法，針對(duì)上述常見(jiàn)染色體異常進(jìn)行產(chǎn)前篩查和診斷，能夠有效防止此類患兒的出生，提高人口素質(zhì)。

產(chǎn)前篩查主要通過(guò)對(duì)孕婦血液中的特異指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，從而篩選出高風(fēng)險(xiǎn)人群。然后針對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)人群進(jìn)行相關(guān)產(chǎn)前診斷進(jìn)行確診。產(chǎn)前診斷通過(guò)絨毛活檢、羊水穿刺及胎兒臍靜脈穿刺等手段獲取胎兒細(xì)胞，從而對(duì)胎兒染色體核型進(jìn)行分析。中孕期羊水穿刺在臨床上應(yīng)用最為廣泛。但是，羊水細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程均為手工操作，耗時(shí)較長(zhǎng)，且存在失敗的可能，效率較低[6]。

熒光原位雜交(fluorescence in situ hybri￣dization，F(xiàn)ISH)技術(shù)利用堿基互補(bǔ)配對(duì)原則將熒光標(biāo)記的探針與目的DNA雜交[7]，通過(guò)熒光顯微鏡觀察雜交后熒光信號(hào)的數(shù)量及類型進(jìn)行判斷。FISH檢測(cè)所需細(xì)胞較少，且無(wú)需細(xì)胞培養(yǎng)，能快速直觀地對(duì)常見(jiàn)的染色體非整倍體進(jìn)行診斷[8]。本研究通過(guò)對(duì)218例唐篩高危孕婦的羊水細(xì)胞進(jìn)行FISH及染色體核型分析檢測(cè)，進(jìn)一步探討FISH在唐篩高危人群快速產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1研究對(duì)象與方法

1.1臨床資料

選擇2012年1月至2016年1月由于唐篩高風(fēng)險(xiǎn)在西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院行羊水穿刺的孕婦218名，平均年齡29.99歲(20～42歲)，平均孕周20+2周(16～33周)。

1.2羊水穿刺取材

在超聲引導(dǎo)下經(jīng)腹壁、子宮壁進(jìn)入羊膜腔抽取羊水25mL，此過(guò)程嚴(yán)格進(jìn)行無(wú)菌操作。其中20mL羊水用于細(xì)胞培養(yǎng)及染色體核型分析，5mL羊水用于FISH檢測(cè)。

1.3 FISH檢測(cè)

1.3.1 FISH探針

FISH探針購(gòu)于美國(guó)VYSIS公司。21號(hào)和13號(hào)探針?lè)謩e用橘紅色和綠色熒光標(biāo)記，18號(hào)、X和Y染色體探針?lè)謩e用藍(lán)色、綠色和紅色熒光標(biāo)記。

1.3.2羊水細(xì)胞處理

將5mL羊水置于15mL無(wú)菌離心管中，1 000r/min離心10min，棄去上清，常規(guī)低滲固定處理，滴片，70℃烤片1h。將玻片置于2×SSC溶液中，37℃孵育1h，再置于胃蛋白酶工作液中消化15min，2×SSC漂洗兩次后，將玻片分別放置于70%乙醇、80%乙醇、100%乙醇中脫水處理1min，自然干燥后，將10μL FISH探針混合物加到玻片雜交區(qū)，加蓋蓋玻片，封片后放入雜交儀中雜交過(guò)夜。漂洗玻片后，4’,6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽染料(4',6-Diamidino-2-Phenylindole,DAPI)復(fù)染，熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞。

1.4羊水細(xì)胞G顯帶核型分析

將15mL羊水離心后，棄上清，將羊水細(xì)胞接種至無(wú)菌培養(yǎng)瓶中，靜置培養(yǎng)1周后，換液后24～48h內(nèi)收獲細(xì)胞，常規(guī)制片，進(jìn)行G顯帶核型分析。按《人類細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際命名體制(ISCN 2013年)》標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行染色體核型分析。每例計(jì)數(shù)30個(gè)細(xì)胞分裂相，分析5個(gè)核型。若為異常核型，則適當(dāng)增加計(jì)數(shù)及分析的核型。

1.5隨訪

于孕婦產(chǎn)后1～6個(gè)月，對(duì)其進(jìn)行電話隨訪。218例患者均隨訪成功，隨訪率為100%。

2結(jié)果

2.1 FISH檢測(cè)結(jié)果

在218例孕婦中，共檢出染色體異常9例，染色體異常率為4.13%，其中21-三體5例，18-三體2例，13-三體1例，45X[25]/46,XY[75]1例，見(jiàn)表1。

2.2羊水細(xì)胞培養(yǎng)及染色體核型分析結(jié)果

218例羊水均培養(yǎng)成功，共檢出染色體異常11例，染色體異常率為5.04%，其中21-三體5例，18-三體2例，13-三體1例，45X[32]/46,XY[68] 1例，平衡易位1例，染色體多態(tài)性1例，見(jiàn)表1。

2.3隨訪

染色體異常病例相關(guān)料見(jiàn)表2。其中9例已引產(chǎn)，其余2例異常染色體核型的胎兒已出生，目前發(fā)育良好，未見(jiàn)明顯異常，另207例結(jié)果正常胎兒目前均已出生，生長(zhǎng)發(fā)育良好，未見(jiàn)異常。所有出生胎兒將對(duì)其進(jìn)行持續(xù)隨訪。

表1異常核型結(jié)果對(duì)比分析(n)

Table 1 Comparative analysis of abnormal chromosome karyotype (n)

表2胎兒染色體異常病例的臨床信息

Table 2 Clinical information of cases of chromosomal abnormality

3結(jié)論

3.1染色體病與唐氏綜合征

染色體病在新生兒中發(fā)病率為0.5%～0.7%[9]，其中21-三體綜合征發(fā)病率最高。21-三體綜合征也稱唐氏綜合征，其在新生兒中發(fā)病率為1/800～1/600[10]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，約2/3的唐氏綜合征胎兒在妊娠早、中期會(huì)發(fā)生自發(fā)流產(chǎn)或胎死宮內(nèi)，因此，其實(shí)際發(fā)病率較新生兒發(fā)病率高[11]。唐氏綜合征主要臨床表現(xiàn)為中重度智力低下，體格發(fā)育遲緩，伴隨多器官功能障礙等。由于唐氏綜合征目前尚無(wú)法治愈，給患者家庭和社會(huì)帶來(lái)很大的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)[12-13]。而孕中期唐氏篩查可以很好地檢出高危人群，并通過(guò)產(chǎn)前診斷進(jìn)行確診。

對(duì)于唐氏綜合征的產(chǎn)前診斷，最常用的是對(duì)孕中期羊水細(xì)胞進(jìn)行染色體核型分析，這也是目前臨床上的金標(biāo)準(zhǔn)。但是，由于核型分析不僅需要細(xì)胞培養(yǎng)，耗時(shí)較長(zhǎng)，而且對(duì)相關(guān)技術(shù)人員要求較高，分析結(jié)果易受到細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)、顯帶技術(shù)及操作人員技術(shù)的影響導(dǎo)致失敗[14]。因此，臨床上需要一種快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的方法對(duì)唐篩高危人群進(jìn)行檢測(cè)。

3.2 FISH技術(shù)的優(yōu)勢(shì)探討

FISH技術(shù)應(yīng)用于羊水細(xì)胞數(shù)目異常檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程并不需要細(xì)胞培養(yǎng)，且操作簡(jiǎn)單、快速，結(jié)果直觀易于觀察。對(duì)于未培養(yǎng)的羊水，只需要少量羊水，即可在24h內(nèi)閱片分析結(jié)果，大大縮短了孕婦等待的時(shí)間，緩解其緊張情緒[8]。因此，對(duì)于唐篩高危人群來(lái)說(shuō)，F(xiàn)ISH技術(shù)可以提供快速診斷。

本研究對(duì)218例唐篩高?；颊叩难蛩?xì)胞進(jìn)行FISH檢測(cè)，共檢出21-三體5例，18-三體2例，13-三體1例，檢出率分別為：2.29%、0.92%、0.46%。此外，還檢測(cè)出1例45X[25]/46,XY[75]，檢出率為0.46%。但是，對(duì)于平衡易位和染色體多態(tài)性的病例，F(xiàn)ISH技術(shù)未能檢出。

已有研究發(fā)現(xiàn)，羊水細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，可能存在來(lái)自于某單個(gè)細(xì)胞形成的細(xì)胞株而出現(xiàn)異常核型，從而造成嵌合核型的現(xiàn)象。而FISH技術(shù)不需要細(xì)胞培養(yǎng)，是此類假嵌合現(xiàn)象的較好的驗(yàn)證方法。此外，研究者還指出FISH技術(shù)應(yīng)用于染色體非整倍體的檢測(cè)結(jié)果基本與染色體核型分析結(jié)果一致[15]。但是由于FISH技術(shù)受探針?lè)N類的限制，只能用特異探針檢出已知的染色體異常，很難在一次實(shí)驗(yàn)中檢出所有的染色體數(shù)量異常及染色體重排等結(jié)構(gòu)異常，這與本研究結(jié)論一致。

3.3結(jié)論

綜上所述，F(xiàn)ISH技術(shù)能夠避免由于細(xì)胞培養(yǎng)失敗帶來(lái)的檢測(cè)失敗，且大大縮短了報(bào)告時(shí)間；而核型分析能夠彌補(bǔ)FISH檢測(cè)局限性等問(wèn)題。臨床上FISH聯(lián)合羊水細(xì)胞培養(yǎng)核型分析，能夠更全面快速地對(duì)唐篩高危人群提供產(chǎn)前診斷信息。