楊佩濃，虞義建，徐偉銘，張曉婷

(1.浙江省臺(tái)州醫(yī)院病理科，浙江 臺(tái)州 317000；2.臺(tái)州恩澤醫(yī)療中心(集團(tuán))恩澤醫(yī)院病理科，浙江 臺(tái)州 318050)

MicroRNA(miRNA)是內(nèi)源性非編碼RNA分子，由18～22個(gè)核苷酸組成，轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[1]。卵巢癌是婦科常見(jiàn)的腫瘤，是腫瘤致女性死亡的重要原因之一。我國(guó)卵巢癌的發(fā)病率約為4.91/10萬(wàn)，且有逐年上升的趨勢(shì)[2]。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明，miRNA與卵巢癌的發(fā)病和發(fā)展密切相關(guān)[3-5]，miRNA-124是近年來(lái)研究較多的miRNA之一，其在肝癌、胃癌、大腸癌、口腔癌和宮頸癌中表達(dá)水平下降，發(fā)揮著類(lèi)似抑癌基因的作用[6-8]。然而，miRNA-124在卵巢癌中的研究較少，本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測(cè)上皮性卵巢癌組織中miRNA-124的表達(dá)水平，分析了其與臨床病理特征的相關(guān)性，探討了其在卵巢癌發(fā)生和發(fā)展中的作用，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

2013年2月至2014年11月在浙江省臺(tái)州醫(yī)院行手術(shù)治療的卵巢癌患者85例，所有患者術(shù)前均未接受過(guò)放化療，術(shù)后經(jīng)過(guò)病理檢查以明確診斷，排除因保存不當(dāng)而導(dǎo)致RNA降解的標(biāo)本。85例患者中，年齡35～71歲，平均(56.32±5.67)歲。按照國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟 (International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO)的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期[9]，其中Ⅰ期11例，占12.94%；Ⅱ期23例，占27.06%；Ⅲ期44例，占51.76%；Ⅳ期7例，占8.23%。病例分級(jí)為G1期16例，占18.82%；G2期45例，占52.94%；G3期24例，占28.24%。另外，選取同期與卵巢癌患者年齡匹配的良性上皮卵巢腫瘤組織35例和正常卵巢組織45例作為對(duì)照，所有標(biāo)準(zhǔn)本均于液氮中保存。本研究已經(jīng)過(guò)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均知情同意。

1.2 miRNA-124的定量檢測(cè)

采用trizol法提取癌組織中的總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(新海基因有限公司，貨號(hào)：D1801)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA第一鏈，在以cDNA為模板，使用RT-PCR檢測(cè)試劑盒(上海信裕生物科技有限公司，貨號(hào)：131042-25)檢測(cè)miRNA-124的表達(dá)水平。miRNA-124上游引物序列為5′-GCTAAGGC￣ACGCGGTG-3′，下游引物序列為5′-GTGCA￣GGGTCCGAGGT-3′；內(nèi)參照U6上游引物序列為5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，下游引物序列為5′-ACGCTTCACGAATTTGC￣GTGTC-3′(引物由天根生化科技有限公司設(shè)計(jì))。PCR反應(yīng)條件：第1步，95℃ 30s；第2步，95℃5s、60℃20s，共40個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，繪制熔解曲線，以2-ΔΔCt值表示miRNA-124的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3隨訪

手術(shù)治療后對(duì)患者進(jìn)行隨訪，隨訪時(shí)間至2017年11月6日。采取門(mén)診隨訪和電話隨訪相結(jié)合，觀察患者的總體生存率和中位生存時(shí)間。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1 miRNA-124在卵巢癌、良性卵巢腫瘤和正常組織中的表達(dá)量差異

卵巢癌組織中miRNA-124相對(duì)表達(dá)量為2.35±1.11，良性卵巢腫瘤組織中的表達(dá)量為5.13±2.01，正常組織中為6.29±2.12。采用單因素方差分析發(fā)現(xiàn)，三組間的比較有明顯差異(F=8.371，P<0.001)。卵巢癌組織中miRNA-124相對(duì)表達(dá)量明顯低于良性卵巢腫瘤組織和正常組織(t值分別為7.123、11.650，均P<0.001)；良性卵巢腫瘤組織中miRNA-124相對(duì)表達(dá)量低于正常組織(t=2.499，P=0.007,見(jiàn)圖1。

注：*與正常組織組比較，P<0.05；#與良性卵巢組織組比較，P<0.05。

圖1 miRNA的相對(duì)表達(dá)量

Fig.1 Relative expression of miRNA

2.2 miRNA-124的相對(duì)表達(dá)量與臨床特征的關(guān)系

臨床分期和組織分級(jí)越高，miRNA的相對(duì)表達(dá)量越低(P<0.05)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，miRNA的相對(duì)表達(dá)量越低(P<0.05)；組織學(xué)類(lèi)型與miRNA的相對(duì)表達(dá)量無(wú)關(guān)(P>0.05)，見(jiàn)表1。

2.3 miRNA的相對(duì)表達(dá)量與生存期的相關(guān)性

如圖2所示，高表達(dá)組的總生存率明顯高于低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.824，P=0.008)。低表達(dá)組中位生存期為(7.91±1.52)個(gè)月，95%CI：3.21～10.73；高表達(dá)組中位生存時(shí)間為(14.53±6.74)個(gè)月，95%CI：11.0～28.4，高表達(dá)組中位生存時(shí)間明顯較低表達(dá)量組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.053，P<0.001)。低表達(dá)組總生存時(shí)間為(28.67±5.01)個(gè)月，95%CI：2.45～9.24；高表達(dá)組總生存時(shí)間為(32.81±4.27)個(gè)月, 95%CI：2.01～6.69，高表達(dá)組總生存時(shí)間高于低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.112，P<0.001)。

圖2生存曲線

Fig. 2 Survival curve

3討論

3.1 miRNA-124的生物學(xué)作用

miRNA在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能[10]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起到重要作用，并且對(duì)腫瘤的診斷和預(yù)后的判斷也有意義[11]。作為新型的分子標(biāo)志物，miRNA可用于惡性腫瘤的早期診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)，其具有廣闊的應(yīng)用前景[12-14]。既往研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-124是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中必不可少的miRNA之一[15-17]，miRNA-124在多種腫瘤組織中的表達(dá)下降，并且對(duì)細(xì)胞的增值、分化、凋亡、遷移和侵襲起著重要作用[6-7,18]。舒錦等[19]發(fā)現(xiàn)卵巢癌組織中的miRNA-124表達(dá)量下降，在體外實(shí)驗(yàn)中，卵巢癌 SKOV3 細(xì)胞中 miR-124 過(guò)表達(dá)可明顯抑制細(xì)胞的增殖、 遷移和侵襲并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

3.2 miRNA-124在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)及意義

miRNA可能為致癌基因，也可能是抑癌基因，可通過(guò)多個(gè)環(huán)節(jié)調(diào)控腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，對(duì)腫瘤組織中miRNA表達(dá)量的檢測(cè)對(duì)疾病的早期診斷和治療有重要意義。本組研究中，臨床分期和組織分級(jí)越高，miRNA的相對(duì)表達(dá)量越低；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，miRNA的相對(duì)表達(dá)量越低；組織學(xué)類(lèi)型與miRNA的相對(duì)表達(dá)量無(wú)關(guān)。miRNA高表達(dá)組的總生存率明顯高于低表達(dá)組(P<0.05)，且高表達(dá)量組中位生存時(shí)間明顯較低表達(dá)量組高(P<0.05)。上述研究結(jié)果表明，miRNA-124的相對(duì)表達(dá)量與腫瘤的預(yù)后和轉(zhuǎn)歸有關(guān)。

綜上，本研究結(jié)果表明，上皮性卵巢癌組織中miRNA-124的相對(duì)表達(dá)量降低，提示其可能在卵巢癌的發(fā)病機(jī)制中起到抑癌基因的作用，另外，miRNA-124的表達(dá)量與卵巢癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)歸有關(guān)。本研究的局限性在于樣本量較小，且為單中心研究，miRNA-124的具體生物學(xué)機(jī)制需要進(jìn)一步研究。