丁曉穎，蔡 燕，楊慧琳，邢秋霞，陸玲玲，程妤奮，沈麗華，黃 鷹

(上海市浦東新區(qū)婦幼保健院婦產(chǎn)科，上海 201206)

早產(chǎn)是現(xiàn)代產(chǎn)科面臨的主要挑戰(zhàn)之一，每年出生的早產(chǎn)兒已達(dá)1 500萬，是新生兒死亡的主要原因，且存活的早產(chǎn)兒中部分遺留智力障礙或神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，給社會和家庭造成極大的負(fù)擔(dān)。目前全球早產(chǎn)平均發(fā)生率約為10%，高居妊娠并發(fā)癥榜首[1]。隨著我國二胎政策的開放，早產(chǎn)兒的數(shù)量預(yù)計將進(jìn)一步升高，早產(chǎn)已是亟待解決的世界性難題。越來越多的研究表明，分娩的啟動類似于一個炎癥反應(yīng)，越早出現(xiàn)的早產(chǎn)越可能是感染所致[2]，白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β，腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α等多種炎癥介質(zhì)參與其中[3]。其中，IL-6的相關(guān)研究較受關(guān)注[4]，但以羊水和血液樣本研究為主；促腎上腺激素釋放激素(corticotrophin-releasing hormone，CRH)則國內(nèi)研究的文獻(xiàn)較少。本研究采用更容易為孕婦接受的宮頸陰道分泌物為研究樣本，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法檢測孕中期婦女多種炎性因子和CRH的水平及其相關(guān)性，為早產(chǎn)的預(yù)測和防治提供更新更為全面的理論依據(jù)。

1資料與方法

1.1一般資料

選擇2015年1月至2017年12月在上海浦東新區(qū)婦幼保健院正規(guī)產(chǎn)檢的孕產(chǎn)婦，無吸煙喝酒等不良嗜好，既往無宮頸機(jī)能不全史，無高血壓、糖尿病、牙周病和上呼吸道感染等合并癥。在孕24～28周，孕婦簽署告知同意書后，進(jìn)行宮頸陰道分泌物采樣凍存待測，并隨訪其妊娠結(jié)局。隨機(jī)抽取早產(chǎn)100例作為研究組，其中自發(fā)性早產(chǎn)71例，胎膜早破早產(chǎn)29例；足月產(chǎn)100例為對照組，兩組分娩方式均為經(jīng)陰道分娩。早產(chǎn)診斷標(biāo)準(zhǔn)：妊娠滿28周至不足37周分娩者[5]。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集及處理

所有研究對象在孕24～28周產(chǎn)檢時，無痛碘消毒外陰，窺陰器撐開陰道暴露宮頸，用無菌棉拭子置于宮頸管及后穹窿部停留約10s以充分吸取宮頸陰道分泌物，后立即將棉拭子放入2mL pH =7.4的磷酸鹽緩沖液中漂洗，2 000r/min離心5min后取上清液，分置于3個Dacon管中于-20℃冰箱凍存待測。取樣前一周禁止性生活。

1.2.2 IL-6、TNF-α和CRH水平的測定

①用雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測IL-6、TNF-α和CRH的濃度(試劑盒由上海西唐生物科技有限公司提供)；②試劑盒及待測樣品提前從冰箱中取出，平衡至室溫；③加樣，每孔各加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100μL，將反應(yīng)板充分混勻后置于37℃下40min；④洗板5次，向濾紙上印干(洗板機(jī)有芬蘭Thermo公司提供)；⑤洗板5次，每孔加酶標(biāo)抗體工作液100μL，將反應(yīng)板放置在37℃下10min；⑥再洗板5次，每孔加入底物工作液100μL，置于37℃暗處反應(yīng)15min；⑦每孔加入100μL終止液混勻，30min內(nèi)用酶標(biāo)儀(由芬蘭Thermo公司提供)在450nm處測吸光值。

以標(biāo)準(zhǔn)品400、200、100、50、25、12.5、6.25、0pg/mL為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，使用軟件作圖，畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品OD值計算出相應(yīng)IL-6、TNF-α和CRH含量，再乘以稀釋倍數(shù)即可。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件包對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，方差齊性分析采用t檢驗，IL-6、TNF-α濃度與CRH水平之間的關(guān)系用線性相關(guān)系數(shù)R2表達(dá)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01為差異顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1一般資料比較

兩組研究對象在年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、采樣孕周等因素進(jìn)行比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，見表1。

表1 兩組孕產(chǎn)婦一般資料比較

2.2兩組孕24～28周宮頸陰道分泌物中IL-6、TNF-α和CRH的水平比較

兩組比較，早產(chǎn)組孕24～28周宮頸陰道分泌物中炎性因子IL-6、TNF-α和CRH的水平都顯著高于足月產(chǎn)組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)，見表2。

2.3宮頸陰道分泌物CRH、IL-6、TNF-α預(yù)測早產(chǎn)的評價

根據(jù)ROC曲線，得出孕24～28周宮頸陰道分泌物中CRH、IL-6、TNF-α預(yù)測早產(chǎn)的曲線，CRH的曲線下面積(AUC)為0.533(P=0.529)，IL-6的AUC為0.782(P<0.001)，TNF-α的AUC為0.890(P<0.001)，見圖1。提示TNF-α是較為準(zhǔn)確的預(yù)測指標(biāo)，IL-6次之；雖然早產(chǎn)組CRH高于足月產(chǎn)組，但是其臨床預(yù)測精確度還不夠。

組別IL-6TNF-αCRH早產(chǎn)組110.82±15.1767.74±10.4836.79±8.34足月產(chǎn)組21.48±12.6522.70±9.0214.46±7.55t45.2308.0623.018P<0.001<0.001<0.001

圖1宮頸陰道分泌物中CRH、IL-6、TNF-α預(yù)測早產(chǎn)的ROC曲線

Fig.1 ROC curve of CRH, IL-6 and TNF-a in cervicovaginal secretions in predicting preterm labor

2.4兩組宮頸陰道分泌物中IL-6、TNF-α濃度與CRH水平的相關(guān)性

進(jìn)一步檢測陰道分泌物中炎性因子濃度與CRH表達(dá)的關(guān)系，對早產(chǎn)組孕中期宮頸陰道分泌物中IL-6、TNF-α的濃度與CRH的水平進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)早產(chǎn)組IL-6水平與CRH的表達(dá)呈顯著正相關(guān)(R2=0.590，P<0.05)，見圖2A；TNF-α的水平與CRH的表達(dá)也呈顯著正相關(guān)(R2=0.223，P<0.05)，見圖2B。足月組IL-6的水平與CRH的表達(dá)也呈正相關(guān)(R2=0.139，P<0.05)，見圖2C；但足月組中TNF-α的水平與CRH的表達(dá)無相關(guān)性(R2=0.000，P>0.05)，見圖2D。

注：A為早產(chǎn)組CRH與IL-6水平的相關(guān)性分析;B為早產(chǎn)組CRH與TNF-α水平的相關(guān)性分析;C為足月組CRH與IL-6水平的相關(guān)性分析；D為足月組CRH與TNF-α水平的相關(guān)性分析。

圖2早產(chǎn)組和足月組孕24～28周宮頸陰道分泌物中CRH水平與IL-6和TNF-α水平的相關(guān)性分析

Fig.2 Correlation between CRH and levels of IL-6 and TNF-α in cervicovaginal secretions in preterm group and full term group in 24-28 gestational weeks

3討論

3.1炎性因子IL-6和TNF-α與早產(chǎn)

早產(chǎn)問題的解決關(guān)鍵在于早預(yù)測、早干預(yù)?；诟腥疽驯还J(rèn)是引起早產(chǎn)的主要原因，國內(nèi)外研究者通過動物模型、人體取樣等方法在炎性細(xì)胞因子與早產(chǎn)方面做了大量研究。其中，IL-6是目前研究的最多的炎性細(xì)胞因子，它主要由單核細(xì)胞產(chǎn)生，正常妊娠婦女蛻膜、絨毛膜和羊膜中富含單核細(xì)胞。適量的IL-6可以在妊娠過程中起到免疫調(diào)節(jié)作用，一旦分泌過多，可激活白細(xì)胞侵入子宮組織，刺激催產(chǎn)素受體的表達(dá)，并通過激活丘腦-垂體-腎上腺軸增加前列腺素的產(chǎn)生，從而啟動分娩發(fā)生。于是，學(xué)者們開始研究用IL-6預(yù)測早產(chǎn)的發(fā)生。目前此類研究大多集中在血清及羊水樣本[6]，但2009年Wei等曾系統(tǒng)性回顧了數(shù)十年間關(guān)于炎癥因子與自發(fā)性早產(chǎn)的相關(guān)性研究，認(rèn)為只有宮頸分泌物和羊水中的IL-6水平升高與自發(fā)性早產(chǎn)密切相關(guān)，尤其是小于32周的極早產(chǎn)，血清中IL-6則不然。近來王雅寧等[7]研究后發(fā)現(xiàn)宮頸陰道分泌物中IL-6可預(yù)測早產(chǎn)發(fā)生，聯(lián)合檢測fFN、CRP等可使早產(chǎn)預(yù)測敏感度增加。本研究以無癥狀的孕中期婦女為研究對象，發(fā)現(xiàn)早產(chǎn)組婦女孕24～28周宮頸陰道分泌物中IL-6的水平明顯高于足月產(chǎn)組，差異有極顯著性(P<0.01)，進(jìn)一步證實了宮頸陰道分泌物中的IL-6水平與自發(fā)性早產(chǎn)密切相關(guān)，且IL-6的ROC曲線的AUC為0.782(P<0.001)，因此認(rèn)為孕中期宮頸分泌物IL-6水平可作為預(yù)測早產(chǎn)的可靠指標(biāo)。

TNF-α是具有多種病理生理效應(yīng)的細(xì)胞因子，主要來源于巨噬細(xì)胞和合體滋養(yǎng)細(xì)胞。Kumar等在2011年體外實驗已經(jīng)證實羊膜與TNF-α和IL-1β共同孵育時張力明顯減弱，彈性降低。本研究顯示，早產(chǎn)組孕中期無癥狀婦女宮頸陰道分泌物中TNF-α水平和IL-6都顯著高于足月組，再次說明了自發(fā)性早產(chǎn)的分娩動因與炎癥反應(yīng)相關(guān)，且TNF-α的ROC曲線的AUC為0.890(P<0.001)，因此，孕中期宮頸分泌物TNF-α水平可作為預(yù)測早產(chǎn)的可靠指標(biāo)。TNF-α誘發(fā)早產(chǎn)的可能機(jī)制是增強(qiáng)了胎膜中基質(zhì)金屬蛋白酶的分泌，通過增加基質(zhì)降解，降低胎膜組織的張力彈性，在前列腺素的作用下引起胎膜破裂而早產(chǎn)。

3.2 CRH與早產(chǎn)預(yù)測

CRH是含41個氨基酸的多肽，最早發(fā)現(xiàn)于下丘腦。后來發(fā)現(xiàn)妊娠期胎盤能分泌大量的CRH，而且隨著妊娠進(jìn)展，逐步增加，在分娩啟動前血漿CRH呈指數(shù)升高。2010年張曉欣等研究后發(fā)現(xiàn)CRH是分娩的啟動子，早產(chǎn)妊娠婦女母體血漿CRH水平不同，其妊娠結(jié)局也不同，早產(chǎn)不可避免的妊娠婦女母體血漿CRH水平明顯高于繼續(xù)妊娠婦女，而早產(chǎn)妊娠婦女經(jīng)過有效抗早產(chǎn)藥物治療后母體血漿CRH明顯回落，提示妊娠期母體血漿CRH水平的高低有可能成為預(yù)測早產(chǎn)的有效指標(biāo)。2012年Gao等研究后發(fā)現(xiàn)CRH還可以調(diào)節(jié)胎盤雌激素、孕激素生成，促進(jìn)胎膜前列腺素的合成和代謝。目前國外也有較多關(guān)于CRH與早產(chǎn)關(guān)系的文獻(xiàn)報道[8-9]。Jeanne等[10]檢測了707例孕22～24周孕婦的靜脈血CRH，發(fā)現(xiàn)當(dāng)血CRH水平≥24pg/mL時，早產(chǎn)的發(fā)生概率提高1.8倍，認(rèn)為血CRH水平可作為預(yù)測早產(chǎn)的重要指標(biāo)。不論在早產(chǎn)還是足月產(chǎn)中，CRH很可能都是調(diào)控分娩啟動的觸發(fā)因子，都與CRH誘發(fā)的炎癥反應(yīng)相關(guān)。但是陰道分泌物中是否含有CRH，它與早產(chǎn)時宮頸炎癥反應(yīng)、宮頸軟化是否相關(guān)，國內(nèi)外目前尚無研究報道。本研究首次檢測孕24～28周陰道分泌物中的CRH，結(jié)果發(fā)現(xiàn)早產(chǎn)的孕婦宮頸陰道分泌物中CRH水平明顯高于足月組，差異有顯著性(P<0.05)，提示早產(chǎn)可能與陰道分泌物中CRH升高密切相關(guān)。CRH的ROC曲線的AUC面積為0.533(P=0.529)，可能還不能單獨作為臨床預(yù)測早產(chǎn)的指標(biāo)，但是，CRH的水平可與TNF-α和IL-6水平相結(jié)合，可提高早產(chǎn)的預(yù)測敏感度。

3.3炎性因子的表達(dá)與CRH的相關(guān)性

本研究發(fā)現(xiàn)炎性因子IL-6、TNF-α與CRH很可能都與早產(chǎn)分娩啟動密切相關(guān)，但它們之間是否存在著相關(guān)性，CRH異常增高是否能上調(diào)炎性因子的表達(dá)，目前尚不清楚。隨著對早產(chǎn)中炎性因子作用的研究愈加深入，國內(nèi)外學(xué)者們發(fā)現(xiàn)CRH在許多組織中也可能是一種炎性因子，促使炎癥反應(yīng)發(fā)生[11-12]，如在自身免疫性疾病關(guān)節(jié)炎等局部炎癥組織中，CRH表達(dá)較多，給予CRH受體拮抗劑可緩解或者阻止炎癥反應(yīng)。You等[13]的研究表明CRH能促進(jìn)子宮平滑肌細(xì)胞炎性因子IL-6、TNF-α等的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)子宮激活蛋白而引起子宮收縮。

由于陰道分泌物是由前庭大腺、子宮頸腺體、子宮內(nèi)膜的分泌物和陰道黏膜的滲出液、脫落的陰道上皮細(xì)胞混合而成，陰道分泌物中的CRH、TNF-α可能是由前庭大腺、子宮頸腺體、子宮內(nèi)膜細(xì)胞等分泌。在分娩啟動過程中，子宮平滑肌細(xì)胞分泌的CRH能夠通過旁分泌的途徑促使子宮肌細(xì)胞產(chǎn)生包括IL-6、TNF-α在內(nèi)的炎性因子，促使子宮肌局部發(fā)生炎癥反應(yīng)。陰道分泌物中的CRH是否也能促進(jìn)IL-6、TNF-α的生成，尚無研究報道。本研究發(fā)現(xiàn)無論早產(chǎn)組還是足月組孕中期的IL-6水平異常增高均與CRH表達(dá)上調(diào)密切相關(guān)，但早產(chǎn)組中關(guān)系更為密切(R2=0.590)；而TNF-α的表達(dá)在早產(chǎn)組中與CRH水平呈正相關(guān)，但在足月組中則表現(xiàn)為無相關(guān)性。CRH可能通過促進(jìn)這些炎癥因子的表達(dá)，誘發(fā)白細(xì)胞遷移，這種調(diào)控的結(jié)果進(jìn)一步引起前列腺素合成增多，促進(jìn)宮頸成熟，胎膜破裂，子宮收縮，在早產(chǎn)分娩啟動中發(fā)揮著重要的作用。因此認(rèn)為CRH不僅可以作為早產(chǎn)預(yù)測指標(biāo)之一，CRH受體拮抗劑也是未來早產(chǎn)防治的一個新方向。

綜上所述，聯(lián)合檢測孕中期母體宮頸陰道分泌物中IL-6、TNF-α和CRH水平，可能成為更容易被孕婦接受且更有效的早產(chǎn)預(yù)測方法，而通過CRH受體拮抗劑來抑制CRH分泌進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)，也為早產(chǎn)的防治提供了一個新途徑。