鄭榮浩，劉冬蕾，黃 力，朱松柏，貴 琳，吳曉林

(湖北省婦幼保健院兒童腎臟風(fēng)濕免疫科，湖北 武漢 430070)

過敏性紫癜(Henoch-Sch?nlein purpura, HSP)又稱亨-舒綜合征，是兒童時期最常見的一種以小血管炎為主要病理改變的自身免疫性疾病，常累及皮膚、胃腸道、關(guān)節(jié)、腎臟等多個系統(tǒng)。如累及腎臟則稱之為紫癜性腎炎(Henoch-Sch?nlein purpura nephritis，HSPN)，嚴重危害兒童健康。HSP發(fā)病機制十分復(fù)雜，目前普遍認為HSP患兒存在細胞免疫及體液免疫功能紊亂，主要以IgA介導(dǎo)的體液免疫異常為主[1]，但具體機制至今尚未闡明。維生素D是一類脂溶性維生素，25-羥維生素D[25-hydroxyvitamin D, 25-(OH)D]是人體內(nèi)最佳的反映維生素D水平的一種存在形式，近年來研究表明，維生素D的生物學(xué)作用已經(jīng)超出以前所認識的，其可通過多種途徑調(diào)節(jié)免疫功能及炎癥反應(yīng)，并在一些自身免疫疾病中起重要的作用[2]。研究表明低水平的維生素D與多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病的發(fā)病風(fēng)險高度相關(guān)，且其活性代謝產(chǎn)物與疾病的發(fā)生及發(fā)展關(guān)系密切[2]。HSP作為一種自身免疫性疾病，而維生素D在其中的表達情況如何國內(nèi)外目前甚少報道，因此本研究檢測HSP患兒的25-(OH)D表達情況并分析其與細胞免疫及體液免疫之間的相關(guān)性。

1資料與方法

1.1研究對象與分組

選擇2016年10月至2018年1月在湖北省婦幼保健院住院的139例HSP患兒作為HSP組，選擇同期在我院門診體檢正常的80例兒童作為健康對照組。139例HSP組患兒根據(jù)是否合并腎臟受累又分為非紫癜性腎炎組(NHSPN組)108例和紫癜性腎炎組(HSPN組)31例。納入標準：HSP的診斷參考2013年中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會免疫學(xué)組提出的診斷標準[1]。HSPN的納入標準：首次發(fā)作的HSP患兒，在急性期內(nèi)出現(xiàn)血尿和(或)蛋白尿，并排除乙肝病毒相關(guān)性腎炎及狼瘡性腎炎等繼發(fā)性腎小球腎炎，具體診斷標準參考2016年中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會腎臟學(xué)組提出的診斷標準[3]。排除標準：①既往3個月內(nèi)使用任何形式的維生素D治療或補充者；②既往伴有遺傳、代謝、免疫缺陷性疾病，慢性肝腎和消化道疾病，以及活動性佝僂病史。

1.2檢測方法

1.2.1標本采集

所有HSP組患兒均在使用激素、免疫抑制劑和維生素D治療前采集靜脈血6mL，健康對照組兒童在補充維生素D前空腹采集靜脈血6mL，于8小時內(nèi)進行外周血25-(OH)D、T淋巴細胞亞群(CD3+T、CD4+T及CD8+T)、自然殺傷細胞(NK細胞，即CD16+CD56+)、B細胞(CD19+)水平、IgA、IgG、IgM、IgE、C3及C4的水平等檢測。

1.2.2血清25-(OH)D水平的檢測

采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測，儀器為島津公司的三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(型號：島津8050)。具體步驟為：取血清200μL，加內(nèi)標溶液(25-羥基維生素D3-氘6和25-羥基維生素D2-氘3)按1∶1比例混合；加10μL甲酸水后常溫下10 000r/min離心5min；取上清液200μL,加正乙烷，再次常溫下10 000r/min離心10min；分層后取上層，氮氣吹干；加復(fù)溶液100μL，上機檢測。

1.2.3免疫指標的檢測

使用美國BD公司FACSCantoⅡ進行流式細胞術(shù)檢測HSP患兒的T淋巴細胞亞群、NK細胞及B細胞水平，試劑購自碧迪醫(yī)療器械(上海)有限公司；采用美國Beckman公司的Immage800進行免疫比濁法檢測HSP患兒外周血IgA、IgG、IgM、IgE、C3、C4及C50的水平，試劑為美國Beckman公司的配套試劑；具體操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。

1.3倫理審查

本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理道德委員會審查并批準，所有入選患兒家屬均簽署知情同意書。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計分析。正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差表示；多樣本之間均數(shù)進行比較，采用方差分析；兩組間采取獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料采取卡方檢驗；使用二元Logistic回歸分析25-(OH)D影響HSP患兒發(fā)病及并發(fā)HSPN的風(fēng)險，并采用多元線性回歸分析血清25-(OH)D與各免疫指標的相關(guān)性；以α=0.05為檢驗水準，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1一般臨床資料比較

各組兒童年齡、性別、身高、體重、抽血季節(jié)及體質(zhì)量指數(shù)間無明顯統(tǒng)計學(xué)差異，見表1。

表1 各組兒童一般情況的比較

2.2血清25-(OH)D在各組兒童中的表達情況

HSP組患兒的血清25-(OH)D水平明顯低于健康對照組(t=-9.103,P<0.001)，HSPN組患兒血清25-(OH)D水平分別低于NHSPN組和健康對照組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(t值分別為2.857、-8.955,均P<0.05)，見表2。

組別例數(shù)(n)25-(OH)D(ng/mL)健康對照組8042.318±16.980HSP組13923.262±10.400*NHSPN組10824.657±10.062*HSPN組3118.793±10.109*&

注：*與健康對照組相比t值分別為-9.103、-8.955、8.955,均P<0.05；&與NHSPN組相比t=2.857,P=0.005。

2.3各組兒童在不同季節(jié)血清25-(OH)D的表達情況

62例3～9月發(fā)病的HSP組患兒中有13例并發(fā)HSPN，77例9月～次年3月發(fā)病的HSP組患兒中有18例并發(fā)HSPN。3～<9月發(fā)病和9月～次年3月發(fā)病的HSP組患兒血清25-(OH)D水平分別低于同時間段健康對照組兒童(t值分別為-8.347、-4.562，均P<0.05)，但9月～次年3月發(fā)病的HSPN組患兒血清25-(OH)D水平與同時間段NHSPN組患兒的比較無明顯差異(t=1.336，P=0.186)，見表3。

2.4血清25-(OH)D與HSP患兒發(fā)病及并發(fā)HSPN的風(fēng)險關(guān)系分析

血清25-(OH)D影響HSP患病及并發(fā)HSPN的二元Logistic回歸分析顯示，健康對照組兒童血清25-(OH)D水平每降低1ng/mL，其發(fā)生HSP的風(fēng)險將增加至原來的1.103倍(OR=1.103,95%CI:1.073～1.133,P<0.001)，而HSP組患兒25-(OH)D水平每升高1ng/mL，其發(fā)生腎臟受累的風(fēng)險降低至原來的0.939倍(OR=0.939,95%CI:0.897～0.983,P=0.007)，見表4和表5。

組別3～<9月9月～次年3月健康對照組45.326±13.99938.249±19.831HSP組25.491±10.703*21.954±9.580**NHSPN組27.464±9.940*22.755±9.373**HSPN組18.054±10.552*19.327±10.052**

注：*與同時間段健康對照組相比t值分別為-8.347、-7.129、-2.997,均P<0.05；**與同時間段健康對照組相比t值分別為-4.562、-4.288、4.565,均P<0.05。

表4血清25-(OH)D影響HSP發(fā)病的二元Logistic回歸分析結(jié)果

Table 4 Binary Logistical regression analysis of serum 25-(OH)D influencing the incidence of HSP

表5血清25-(OH)D影響HSP并發(fā)腎臟受累的二元Logistic回歸分析結(jié)果

Table 5 Binary Logistical regression analysis of serum 25-(OH)D influencing HSP with renal involvement

2.5血清25-(OH)D與各免疫指標間的相關(guān)性

將HSP組患兒的CD3+T、CD4+T、CD8+T、NK細胞(CD16+CD56+)、B細胞(CD19+)、IgA、IgG、IgM、IgE、C3、C4及CD4+T/CD8+T比值等各因素與25-(OH)D進行多元線性回歸分析，因淋巴細胞亞群各組的絕對數(shù)量差異較大，故本研究采用淋巴細胞亞群之間的相對百分率來表示其水平，回歸模型采用逐步回歸法，最后進入回歸模型的因素有CD8+T和IgA，HSP患兒血清25-(OH)D水平與IgA及CD8+T水平呈負相關(guān)(β=-0.418，t=-5.538，P<0.001；β=-0.231，t=-3.064，P=0.003)，見表6。

表6 血清25-(OH)D與各免疫指標之間的多元線性回歸分析結(jié)果

3討論

3.1 25-(OH)D的水平在HSP患兒中的變化

維生素D是一類脂溶性維生素，經(jīng)紫外線照射皮膚合成和食物攝取的維生素D先經(jīng)過肝臟轉(zhuǎn)化為25-(OH)D，再經(jīng)過腎臟轉(zhuǎn)化為1,25-二羥維生素D[1,25-Hydroxyvitamin D，1,25-(OH)2D]，最后通過作用于細胞的維生素D受體(Vitamin D receptors,VDR)發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。25-(OH)D及1,25-(OH)2D均為維生素D在血液中的存在形式，但因為25-(OH)D半衰期長，在血液中濃度穩(wěn)定，故25-(OH)D是反映體內(nèi)維生素D水平的最佳指標。研究表明維生素D的水平在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病中明顯降低，且可能在免疫性疾病發(fā)病機制中起重要作用[2]。本研究顯示，HSP患兒血清25-(OH)D水平明顯低于健康對照組，HSPN組患兒血清25-(OH)D水平低于NHSPN組和健康對照組，這與郭桂梅等[4]及張遠達等[5]研究結(jié)果一致，雖然他們測定的不是25-(OH)D水平，但都是維生素D的不同代謝產(chǎn)物，這提示維生素D可能參了HSP的發(fā)病過程，并可能與其腎臟受累有一定關(guān)系。

3.2 25-(OH)D與免疫功能的關(guān)系

T細胞功能改變，B細胞多克隆活化，體液免疫反應(yīng)總體處于亢進狀態(tài)，特別是以IgA介導(dǎo)的體液免疫異常等在HSP發(fā)病中起重要作用[1]。本研究顯示HSP患兒血清25-(OH)D水平與CD8+T及IgA水平呈負相關(guān)，表明25-(OH)D可能參與了HSP的免疫發(fā)病機制，與細胞免疫及體液免疫均有關(guān)。研究表明維生素D除參與鈣磷代謝外，可通過多種途徑調(diào)節(jié)人體的免疫功能。Lysandropoulos等[6]的研究表明1,25-(OH)2D可以下調(diào)CD8+T細胞水平并抑制其產(chǎn)生細胞因子γ-干擾素和腫瘤壞死因子-α，而且VDR基因敲除的老鼠體內(nèi)也顯示升高的CD8+T細胞水平，這可以解釋本研究HSP患兒的25-(OH)D與CD8+T呈負相關(guān)的關(guān)系。濾泡輔助性T細胞(follicular helper T cells, Tfh細胞)是近年來被命名的一類新的CD4+T細胞亞群，主要負責(zé)輔助B細胞激活、增生及分化而影響免疫球蛋白的產(chǎn)生[7]。鄒敏書等[8]的研究顯示HSP患者體內(nèi)存在高表達的Tfh細胞，且維生素D可以通過降低Tfh細胞水平來改善HSP體內(nèi)的免疫反應(yīng)。1,25-(OH)2D也可多方面影響B(tài)細胞，抑制其增殖、免疫球蛋白類型轉(zhuǎn)化及抗體的生成[2]。本研究顯示HSP患兒血清25-(OH)D水平降低，且與IgA水平呈負相關(guān)，因此我們推測患兒體內(nèi)低水平的維生素D也許不能通過降低Tfh細胞而完全作用于B細胞來抑制免疫球蛋白的產(chǎn)生，導(dǎo)致HSP體內(nèi)高水平的IgA狀態(tài)，從而進一步造成大量IgA沉積于腎臟引起腎臟受累，這也可以解釋本研究HSPN組的25-(OH)D水平更低的原因。體內(nèi)及體外實驗均顯示，維生素D活性的降低與IgE的升高相關(guān)[9]，維生素D也可通過抑制核因子-κB的信號通路途徑來抑制IgE的抗體類別轉(zhuǎn)換[10]，鑒于哮喘和一些過敏性疾病中也存在維生素D缺乏，因此有學(xué)者認為維生素D缺乏與哮喘和一些過敏性疾病的高IgE水平有關(guān)[2]。但本研究未發(fā)現(xiàn)25-(OH)D與IgE之間存在明顯的相關(guān)性，一方面可能是HSP作為一種自身免疫性疾病，過敏因素并不是HSP的主要病因，另一方面可能因為維生素D在不同疾病中對免疫反應(yīng)的影響不一致有關(guān)。1,25-(OH)2D也可影響輔助性T細胞1(helper T cell 1,Th1)、Th2、調(diào)節(jié)性T細胞以及Th17細胞等CD4+T細胞亞群，但目前主要聚集在多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病的研究中[2]。

3.3 25-(OH)D與HSP患兒發(fā)病及并發(fā)HSPN的風(fēng)險關(guān)系

本研究顯示25-(OH)D為影響HSP發(fā)病及并發(fā)HSPN的危險因素，健康兒童血清25-(OH)D水平每降低1ng/mL，其發(fā)生HSP的風(fēng)險將增加至原來的1.103倍，而HSP患兒25-(OH)D水平每升高1ng/mL，其發(fā)生腎臟受累的風(fēng)險降低至原來的0.939倍。一些臨床研究初步表明，補充維生素D可能降低類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的復(fù)發(fā)及減少系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者抗雙鏈DNA的陽性率[11]，鄒敏書等[8]的研究表明維生素D治療可以改善HSP患兒的免疫功能，因此HSP患兒尤其是并發(fā)腎臟受累者的治療有必要進行維生素D的治療或補充。目前，維生素D水平低下的參考值是整個健康人群維持正常骨骼代謝所需的最小值，然而對于可以維持免疫調(diào)節(jié)作用的維生素D的水平尚不明確，有研究認為對于風(fēng)濕免疫性疾病應(yīng)給予高于健康兒童維生素D推薦劑量的2～3倍[12]，但具體劑量及療效尚需進一步的研究。

總之，維生素D在自身免疫性疾病中的作用已成為一個研究熱點。本研究表明，維生素D在HSP中水平降低且與細胞免疫及體液免疫均相關(guān)，因此，維生素D的水平改變及其作用與HSP的關(guān)系具有極其重要的研究價值。