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(空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，陜西 西安 710032)

海水淹溺是引起意外性死亡的常見因素之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全世界每年由于淹溺造成的死亡人數(shù)為150萬左右，其中大部分為海水淹溺[1]。在海水淹溺造成的死亡當(dāng)中，兒童及少年占了很大比重，這與兒童自救意識(shí)和能力差有很大關(guān)系。盡管政府及醫(yī)療機(jī)構(gòu)對防治兒童淹溺做了大量的宣傳，但兒童每年淹溺的人數(shù)仍居高不下。在海水淹溺發(fā)生后，呼吸及心跳驟停是引起患兒死亡的重要原因，而多數(shù)因自救或他救存活下來的患兒會(huì)伴隨較為嚴(yán)重的急性肺損傷[2-3]。大量關(guān)于海水吸入性肺損傷的研究表明，肺組織中難以清除的水腫液是引起機(jī)體缺氧、呼吸困難甚至后期肺組織結(jié)構(gòu)改變的重要因素。

研究表明，海水吸入肺組織后，由于肺泡腔內(nèi)瞬間達(dá)到高滲的狀態(tài)，液體會(huì)從血管及組織細(xì)胞中轉(zhuǎn)移至肺泡腔內(nèi)[4-5]。機(jī)體后續(xù)水腫液的清除主要通過肺泡上皮細(xì)胞表面的離子通道及水通道蛋白發(fā)揮作用[6]。離子通道方面，肺泡腔一側(cè)的Na+離子通道會(huì)將肺泡腔中的Na+離子轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)，位于細(xì)胞基底部的Na+-K+-ATP酶會(huì)以主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的方式將細(xì)胞內(nèi)高濃度的Na+離子轉(zhuǎn)運(yùn)至間質(zhì)及血液中[7]；而肺泡腔內(nèi)的水分則是伴隨著Na+離子濃度梯度的改變一起轉(zhuǎn)運(yùn)至間質(zhì)及血液中。水通道蛋白(aquaporin，AQP)是轉(zhuǎn)運(yùn)水分子的專用蛋白通道，研究表明在肺泡細(xì)胞中發(fā)揮重要作用的蛋白是AQP1和AQP5[8]。在肺泡腔出現(xiàn)水腫液后，位于肺泡細(xì)胞表面的水通道蛋白會(huì)將水分轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)，然后再由基底部的水通道蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至血液或間質(zhì)中。之前關(guān)于海水吸入性肺損傷成年動(dòng)物模型中，海水刺激后Na+-K+-ATP酶及AQP1、AQP5的表達(dá)和活性都受到了不同程度的抑制，從而影響了肺水腫的清除，但幼年動(dòng)物模型中在該方面的改變尚不清楚。

1,25-二羥維生素D3[1,25-(OH)2VitD3]在鈣離子代謝中有至關(guān)重要的作用，除此之外，還具有多種方面的功效[9]。在小鼠脂多糖導(dǎo)致的急性肺損傷模型中，1,25-二羥維生素D3有減輕肺組織水腫及炎癥細(xì)胞浸潤的作用[10-11]。在海水吸入性肺損傷中，1,25-二羥維生素D3也具有抑制炎癥因子表達(dá)和減輕水腫的作用，但其在幼年海水吸入性肺損傷動(dòng)物模型中對肺水腫的作用及機(jī)制尚不清楚。本研究通過構(gòu)建幼鼠海水吸入性肺損傷模型，探究了1,25-二羥維生素D3在幼鼠海水吸入性肺損傷中對肺組織水腫的作用，并檢測了與Na+-K+-ATP酶及水通道蛋白的關(guān)系。此外，地塞米松作為臨床上公認(rèn)的治療各類急性肺損傷的藥物，對海水吸入性肺損傷的治療同樣有著顯著的效果，因此本研究中將地塞米松作為治療效果對照。

1材料與方法

1.1藥品及試劑

實(shí)驗(yàn)中所用1,25-二羥維生素D3和地塞米松試劑均購自Sigma公司，其中1,25-二羥維生素D3用10%甲醇-1‰Triton X-100溶液配制成的混懸液通過灌胃方式進(jìn)行給藥，地塞米松用5‰羧甲基纖維素鈉溶液制成混懸液也通過灌胃給藥。實(shí)驗(yàn)用配方海水(中國海洋局提供)成分包含：NaCl 26.518g/L，MgSO43.305g/L，MgCl22.447g/L，CaCl21.141g/L，NaHCO30.202g/L，KCl 0.725g/L，NaBr 0.083g/L；pH 8.2，相對密度1.05，滲透壓1 300mmol/L。β-actin、Na+-K+-ATP酶、AQP1和AQP5抗體均購于Cell Signaling Technology( CST)公司。實(shí)驗(yàn)中其他試劑和藥物均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

本研究自2016年7月開始，2017年7月終止。21日齡SD(Sprague-Dawley)幼鼠(雄性、44～61g)，由空軍軍醫(yī)大學(xué)(第四軍醫(yī)大學(xué))實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。海水刺激對肺組織濕干比(W/D)、通透性及離子通道改變的研究分組為：海水刺激0h、1h、4h、6h組。1,25-二羥維生素D3對濕干比、通透性及離子通道蛋白的影響部分實(shí)驗(yàn)分組為：A空白對照組，B海水吸入6h組，C海水吸入6h+VitD3預(yù)處理組，D海水吸入6h+地塞米松預(yù)處理組。造模前1h給各組幼鼠通過灌胃的方式給藥，A和B組：生理鹽水；C組：25μg/kg VitD3；D組：10mg/kg地塞米松。幼鼠海水吸入性肺損傷模型的制備：首先幼鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉(1.5mL/kg)進(jìn)行麻醉，仰臥固定后，頸部正中切口暴露氣管，用1mL的注射器插入氣管，在4min之內(nèi)緩慢滴注3mL/kg海水。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1幼鼠肺組織濕干比檢測方法

造模完成后取每只幼鼠右側(cè)肺組織，快速擦干肺表面后立即稱量即為肺組織濕重，然后將各組肺組織置于70°C烘箱中烘干，72h后進(jìn)行稱重即為干重，用濕重除以干重即為各只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的濕干比。

1.3.2伊文思藍(lán)法檢測海水刺激后幼鼠肺組織通透性

造模完成后，將20mg/kg伊文思藍(lán)溶液通過尾靜脈注射到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)，然后迅速處死幼鼠并取出幼鼠心臟和肺組織，將生理鹽水注入右心室，反復(fù)沖洗幼鼠肺組織，直到左心房流出液轉(zhuǎn)為清亮。然后，將肺組織在烘箱中60°C下烘干，72h后進(jìn)行稱重并放入甲酰胺中(3mL每100mg組織)，充分溶解后將上清液離心30min，用分光光度計(jì)在620nm波長下檢測，通過比對伊文思藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出各樣本中伊文思藍(lán)濃度(μg/g組織)。

1.3.3 Western blot法檢測Na+-K+-ATP酶、AQP1和AQP5蛋白的表達(dá)情況

首先各組幼鼠取等量的左側(cè)肺組織，加入RIPA裂解液并在冰上進(jìn)行組織勻漿，離心后收集含有蛋白的上清液，BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量，沸水煮15min，SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜并用脫脂奶粉封閉；加入一抗(1:1 000稀釋)，4°C過夜，加入羊抗兔二抗(1:5 000稀釋)，37°C孵育1h，ECL顯色并照相，圖像做灰度掃描處理。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1海水刺激后幼鼠肺組織濕干比和伊文思藍(lán)通透性的改變

海水刺激后，肺組織濕干比和通透性明顯增加(均P<0.001)；且在刺激1h后達(dá)到高峰，其后隨著時(shí)間的延長，濕干比和通透性改變略有下降，見圖1、表1、表2。

注：伊文思藍(lán)(Evans blue)。

表2不同組間幼鼠肺組織濕干比和伊文思藍(lán)通透性的檢測結(jié)果對比

Table 2 Comparison of W/D ratio and Evans blue permeability test results among different groups of young rats

注：A為空白對照組，B為海水1h組，C為海水4h組，D為海水6h組，***為與空白對照組比較P<0.001。

圖1幼鼠肺組織濕干比和伊文思藍(lán)通透性的檢測結(jié)果

Fig.1 W/D ratio and Evans blue permeability in lung tissues of young rats

2.2 1,25-二羥維生素D3對海水刺激后幼鼠肺組織濕干比和通透性的影響

海水刺激6h后，肺組織濕干比和通透性均出現(xiàn)了顯著的增加(均P<0.001)；而VitD3和地塞米松的預(yù)處理能夠明顯降低了濕干比和通透性的改變，且VitD3預(yù)處理組效果稍好于地塞米松預(yù)處理組，見表3、表4、圖2。

損傷指標(biāo)ABCDW/D3.13±0.335.45±0.454.20±0.374.50±0.45Evans blue21.00±4.5577.00±8.2053.00±6.9857.00±6.98

表4不同組間幼鼠肺組織濕干比和伊文思藍(lán)通透性檢測結(jié)果對比

Table 4 Comparison of W/D ratio and Evans blue permeability test results among different groups of young rats

注：A為空白對照組，B為海水6h組，C為海水6h+VitD3預(yù)處理組，D為海水6h+地塞米松預(yù)處理組；***為與空白對照組比較P<0.001，##為與海水6h組比較P<0.01，#為與海水6h組比較P<0.05。

圖2幼鼠肺組織濕干比和伊文思藍(lán)通透性結(jié)果

Fig.2 W/D ratio and Evans blue permeability in lung tissues of young rats

2.3海水刺激后幼鼠肺組織中Na+-K+-ATP酶、AQP1和AQP5蛋白表達(dá)的改變

海水刺激后幼鼠肺組織中Na+-K+-ATP酶、AQP1和AQP5蛋白表達(dá)隨刺激時(shí)間的延長逐漸減少，見表5、表6、圖3。

表6不同組間幼鼠肺組織Na+-K+-ATP酶、AQP1和AQP5蛋白表達(dá)檢測結(jié)果對比

Table 6 Comparison of expressions of Na+-K+- ATPase, AQP1 and AQP5 in lung tissues among different groups of young rats

注：A為空白對照組，B為海水1h組，C為海水4h組，D為海水6h組；***為與空白對照組比較P<0.001。

圖3幼鼠肺組織Na+-K+-ATP酶、AQP1和AQP5蛋白表達(dá)檢測結(jié)果

Fig.3 Expressions of Na+-K+-ATPase, AQP1 and AQP5 in lung tissues of young rats

2.4 1,25-二羥維生素D3對海水刺激后幼鼠肺組織中Na+-K+-ATP酶、AQP1和AQP5蛋白表達(dá)的影響

海水刺激6h后，幼鼠肺組織中Na+-K+-ATP酶、AQP1和AQP5蛋白表達(dá)出現(xiàn)了顯著的下降(均P<0.001)；而VitD3和地塞米松的預(yù)處理能夠明顯提升Na+-K+-ATP酶、AQP1和AQP5蛋白表達(dá)，且VitD3預(yù)處理組效果稍好于地塞米松預(yù)處理組，見表7、表8、圖4。

表8不同組間幼鼠肺組織Na+-K+-ATP酶、AQP1和AQP5蛋白表達(dá)檢測結(jié)果對比

Table 8 Comparison of expressions of Na+-K+-ATPase, AQP1 and AQP5 in lung tissues among different groups of young rats

注：A為空白對照組，B為海水6h組，C為海水6h+VitD3預(yù)處理組，D為海水6h+地塞米松預(yù)處理組；***為與空白對照組比較P<0.001，###為海水6h組比較P<0.001，##為海水6h組比較P<0.01，#為海水6h組比較P<0.05。

圖4幼鼠肺組織Na+-K+-ATP酶、AQP1和AQP5蛋白表達(dá)檢測結(jié)果

Fig.4 Expressions of Na+-K+-ATPase, AQP1 and AQP5 in lung tissues of young rats

3討論

本研究中檢測了1,25-二羥維生素D3對幼鼠海水吸入性肺損傷中肺組織水腫的影響。海水刺激后，幼鼠肺組織濕干比、伊文思藍(lán)通透性同時(shí)出現(xiàn)了顯著的增加，而1,25-二羥維生素D3的預(yù)處理則能夠顯著減輕肺組織濕干比和通透性的改變，即減輕了肺水腫的發(fā)生。此外，Na+-K+-ATP酶、AQP1和AQP5蛋白表達(dá)的改變參與了幼鼠海水吸入性肺損傷中肺組織水腫的發(fā)生和發(fā)展。在海水刺激后，Na+-K+-ATP酶、AQP1和AQP5蛋白表達(dá)出現(xiàn)了不同程度的減少，影響了對肺泡腔內(nèi)水腫液的吸收。而1,25-二羥維生素D3的預(yù)處理則能夠顯著促進(jìn)Na+-K+-ATP酶、AQP1和AQP5蛋白的表達(dá)。

3.1海水刺激對肺組織中Na+-K+-ATP酶、AQP1和AQP5表達(dá)的影響

海水淹溺是導(dǎo)致兒童意外性死亡的重要原因之一，而淹溺后存活下來的患兒往往都伴隨著急性肺損傷的發(fā)生，肺水腫是海水吸入性肺損傷最主要的病理改變，因此，減輕肺水腫對于治療患兒的肺損傷尤為重要[12]。之前關(guān)于肺水腫的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，離子通道和水通道蛋白在水腫液的吸收中發(fā)揮了重要的作用[7-8]。一方面，肺泡腔一側(cè)的Na+離子通道會(huì)將水腫液中的Na+離子轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)，位于細(xì)胞基底部的Na+-K+-ATP酶會(huì)以主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的方式將細(xì)胞內(nèi)高濃度的Na+離子轉(zhuǎn)運(yùn)至間質(zhì)及血液中，而肺泡腔內(nèi)的水分則會(huì)伴隨著Na+離子濃度梯度的改變一起轉(zhuǎn)運(yùn)至間質(zhì)及血液中。另一方面，在肺泡腔出現(xiàn)水腫液后，位于肺泡細(xì)胞表面的水通道蛋白會(huì)將水分轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)，然后再由基底部的水通道蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至血液或間質(zhì)中。而有研究表明，肺泡細(xì)胞中表達(dá)的最主要的水通道蛋白為AQP1和AQP5蛋白。本研究中發(fā)現(xiàn)海水刺激后肺組織水腫增加的同時(shí)，Na+-K+-ATP酶、AQP1和AQP5蛋白呈現(xiàn)出下降的趨勢，正是因?yàn)檫@些蛋白表達(dá)下降，使海水刺激后肺水腫的吸收效率出現(xiàn)下降[8]。

3.2 1,25-二羥維生素D3在減輕海水刺激引起肺組織水腫中的作用機(jī)制

1,25-二羥維生素D3是維生素D3的活性成分，在很多方面都有重要作用[13]。在小鼠脂多糖導(dǎo)致的急性肺損傷模型中，1,25-二羥維生素D3有減輕肺組織水腫及炎癥細(xì)胞浸潤的作用。在海水吸入性肺損傷中，1,25-二羥維生素D3也具有抑制炎癥因子表達(dá)和減輕水腫的作用。本研究中，1,25-二羥維生素D3明顯的減輕了肺組織水腫，同時(shí)使Na+-K+-ATP酶、AQP1和AQP5蛋白的表達(dá)出現(xiàn)了回調(diào)。正是因?yàn)樯险{(diào)了這些蛋白的表達(dá)，才使得藥物增加了肺水腫的清除效率。這些結(jié)果證實(shí)了1,25-二羥維生素D3減輕幼鼠海水肺損傷中肺組織水腫是通過上調(diào)Na+-K+-ATP酶、AQP1和AQP5蛋白達(dá)成的，也為1,25-二羥維生素D3治療幼兒海水吸入性肺損傷提供了基礎(chǔ)和依據(jù)。