陳 冉，馮思豫，蔡春爾，何培民

( 上海海洋大學(xué) 海洋生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，上海 201306 )

資源環(huán)境的匱乏對(duì)于當(dāng)前世界經(jīng)濟(jì)來(lái)說(shuō)形勢(shì)嚴(yán)峻，高效利用藻類資源意義重大。石莼多糖具有抗凝[1]、抗氧化[2]、降血脂[3]、抗腫瘤[4]等潛在的生物學(xué)價(jià)值。但因其分子量和黏度大，溶解度低，導(dǎo)致機(jī)體吸收困難，石莼多糖降解后的產(chǎn)物如葡萄糖醛酸和鼠李糖硫酸酯是潛在的功能寡糖。葡萄糖醛酸具有保護(hù)肝臟、排解毒素的作用，是食藥、化工等產(chǎn)品的主要添加劑[5]。鼠李糖是目前自然界發(fā)現(xiàn)僅有的兩種天然6-脫氧己醛糖之一，可參與合成強(qiáng)心苷類藥物和外源凝集素等[6]。

常見(jiàn)的制備石莼寡糖的方法包括酸解法[7]和酶解法。微波輔助酸解法[8]、抗壞血酸結(jié)合過(guò)氧化氫法[9]等酸法降解雖然操作簡(jiǎn)便，但產(chǎn)物成分復(fù)雜，增加分離難度，且廢液環(huán)境污染嚴(yán)重，此外酸解作用的糖鏈斷裂目標(biāo)位點(diǎn)隨機(jī)，很難獲得完整、有活性的寡糖。隨著海藻工具酶研究報(bào)道的相繼涌出，酶解法生產(chǎn)海藻低聚糖是優(yōu)于化學(xué)降解法的一項(xiàng)行之有效的技術(shù)。海藻工具酶的主要來(lái)源是海洋細(xì)菌。相比之下，酶解法反應(yīng)條件溫和，靶點(diǎn)明確，分離回收容易，最重要的是對(duì)環(huán)境友好，酶解法不會(huì)產(chǎn)生工業(yè)廢氣、廢水，在一定程度上緩解了環(huán)境承載力。同時(shí)還較好的保留了海藻糖鏈的活性基團(tuán)，具有高效、穩(wěn)定、環(huán)保的特點(diǎn)[10]，更加受到研究者的關(guān)注。第一個(gè)被開(kāi)發(fā)的石莼多糖裂解酶是Myvall Collén等[11]于2011發(fā)現(xiàn)的源于某種海洋細(xì)菌黃桿菌Persicivirgaulvanivorans分泌的胞外酶。它可以定點(diǎn)水解糖苷鍵，從而獲得活性寡糖，該酶也是一種新的海藻工具酶。

在綠藻膠酶家族中，尚未見(jiàn)異源表達(dá)的報(bào)道。筆者率先使用基因工程和蛋白質(zhì)工程技術(shù)來(lái)制備石莼多糖裂解酶，人工合成石莼多糖裂解酶基因，比較不同原核表達(dá)載體和受體重組轉(zhuǎn)化表達(dá)石莼多糖裂解酶的效果，不斷地優(yōu)化原核表達(dá)條件，為批量制備低成本、高純度的石莼多糖裂解酶提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

質(zhì)粒pET-28a(+)和感受態(tài)大腸桿菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)LysS購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司；pColdⅠ質(zhì)粒和感受態(tài)大腸桿菌RP(DE3)購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；根據(jù)已知石莼多糖裂解酶基因序列(GenBank:JN104480.1、AEN28574.1)，委托上海邁浦生物科技有限公司設(shè)計(jì)并合成長(zhǎng)度為1605 bp的DNA片段。T4DNA連接酶、TaqDNA polymerase、氨芐青霉素、卡那霉素、限制性內(nèi)切酶(HindⅢ、XbaⅠ、XhoⅠ)和質(zhì)粒提取試劑盒等購(gòu)自全式金生物科技有限公司；石莼多糖裂解酶蛋白(代號(hào)859)抗體制備委托強(qiáng)耀生物科技有限公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)識(shí)的鼠抗兔抗體859-R1購(gòu)自博士德生物科技有限公司。

1.2 石莼多糖裂解酶RP(DE3)原核表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建

1.2.1 質(zhì)粒pColdⅠ-859構(gòu)建與表達(dá)

XhoⅠ和HindⅢ內(nèi)切酶雙酶切pColdⅠ質(zhì)粒與859基因片段之后，再重組反應(yīng)。所得重組質(zhì)粒pColdⅠ-859轉(zhuǎn)入RP(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，挑取單菌落至含有氨芐青霉素的液體LB中擴(kuò)增，低溫210 r/min振蕩培養(yǎng)12 h。用試劑盒法提取質(zhì)粒，并測(cè)序驗(yàn)證。然后轉(zhuǎn)至1000 mL相同培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期(OD600約0.6)時(shí)，加入終濃度為0.1 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷，再培養(yǎng)5 h，4 ℃下10 000 r/min離心15 min收集菌體。

1.2.2 重組石莼多糖裂解酶純化與鑒定

上述收集的菌體按1︰4(體積比)加入50 mmol/L的磷酸鹽緩沖液(含1 mmol/L的PMSF蛋白酶抑制劑)以增加蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，冰浴超聲破碎細(xì)胞，提取蛋白，參數(shù)為：300 W，10 s超聲，15 s間隔，重復(fù)30次。離心分離上清液和沉淀。上清液所含蛋白用Ni-NTA預(yù)裝柱純化，上樣后分步洗脫純化，電泳檢測(cè)。

1.3 石莼多糖裂解酶BL21(DE3)LysS原核表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建

1.3.1 質(zhì)粒pET-28a(+)-859構(gòu)建與表達(dá)

XbaⅠ和XhoⅠ內(nèi)切酶雙酶切pColdⅠ質(zhì)粒，pET-28a(+)與859基因片段重組反應(yīng)，所得重組質(zhì)粒pET-28a(+)-859轉(zhuǎn)入BL21(DE3)LysS感受態(tài)細(xì)胞，涂板LB培養(yǎng)基。

1.3.2 重組石莼多糖裂解酶純化與鑒定

上述收集的菌體按步驟1.2.2純化，電泳檢測(cè)，并用牛血清白蛋白試劑盒法測(cè)定含量。取純化的重組蛋白在硝酸纖維素膜上做Western Blot分析，一抗為859-R1，顯影成像。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工合成石莼多糖裂解酶

因?yàn)椴荒艿玫娇煞置谑欢嗵橇呀饷傅募?xì)菌，因此采用化學(xué)方法快速合成石莼多糖裂解酶的全基因，依照石莼多糖裂解酶在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心上的基因序列，不需要模板，設(shè)計(jì)好全長(zhǎng)引物，再使用重疊延伸的方法制備模版DNA。利用PCR體外擴(kuò)增的方法得到雙鏈DNA，即在體外將所有對(duì)應(yīng)的片段混合，經(jīng)PCR反應(yīng)即可拼接得到目的基因片段，即L0076片段(圖1)，并將其分別剪切、連接到pColdⅠ和pET-28a(+)的質(zhì)粒載體上，將重組質(zhì)粒分別命名為pColdⅠ-L0076和pET-28a(+)-L0076。

圖1 重組質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖

2.2 原核重組質(zhì)粒的鑒定

pET-28a(+)質(zhì)粒片段大小為5369 bp，pColdⅠ質(zhì)粒片段大小為4407 bp，合成的目的基因片段大小為1614 bp，重組質(zhì)粒經(jīng)過(guò)雙酶切后，對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳的核酸分析，最后分別在1614、6021 bp和6983 bp的位置上觀察到陽(yáng)性條帶(圖2)，這說(shuō)明載體構(gòu)建基本正確。

2.3 蛋白純化表達(dá)結(jié)果

轉(zhuǎn)化好的大腸桿菌經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)后表達(dá)的蛋白，蛋白樣品分別經(jīng)10%的SDS-PAGE凝膠電泳和考馬斯亮藍(lán)染色分析，發(fā)現(xiàn)RP(DE3)原核表達(dá)系統(tǒng)并未表達(dá)出蛋白(圖3)，而B(niǎo)L21(DE3)LysS原核表達(dá)系統(tǒng)所表達(dá)的蛋白約71 ku(蛋白包含His標(biāo)簽，目的蛋白分子大小約為46 ku)分子量處有明顯蛋白條帶(圖4)，且在變性條件下以Ni-NTA親和層析后用脫鹽柱純化后的蛋白的質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL。BL21(DE3)LysS原核表達(dá)系統(tǒng)所表達(dá)的蛋白純化后，先進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)至NC膜上，分別用一抗和二抗進(jìn)行Western Blot分析并用化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影、定影，將膠片掃描并拍照，用抗體結(jié)合后出現(xiàn)單一的陽(yáng)性條帶(圖4)，且大小約為71 ku，說(shuō)明重組蛋白與目的蛋白相符。

圖2 重組質(zhì)粒的限制性內(nèi)切酶酶切圖譜分析a1.用XhoⅠ、HindⅢ兩種限制性內(nèi)切酶降解的質(zhì)粒片段和目的序列片段，a2.核酸Maker; b1.用XbaⅠ、XhoⅠ兩種限制性內(nèi)切酶降解的質(zhì)粒片段和目的序列片段，b2.核酸Maker.

3 討 論

3.1 關(guān)于多糖裂解酶的特性

近些年低聚糖研究技術(shù)發(fā)展迅速，酶解多糖制備寡糖特異性強(qiáng)，工藝專一，操作條件溫和，環(huán)境友好，優(yōu)于酸法制備。海洋生物功能酶的早期研究主要是對(duì)細(xì)胞壁的降解獲得原生質(zhì)體，如瓊膠酶、卡拉膠酶、褐藻膠裂合酶、巖藻膠酶[12-14]等。而用基因工程和蛋白質(zhì)工程的方法人工獲得海藻工具酶的研究報(bào)道目前還較少，綠藻膠酶的報(bào)道更少。利用原核表達(dá)系統(tǒng)，異源表達(dá)目的蛋白酶，體外就能獲得可降解多糖的酶。選擇合適的表達(dá)系統(tǒng)，要綜合考慮表達(dá)載體、宿主菌、誘導(dǎo)條件等，還要綜合考慮蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程中的諸多因素，設(shè)計(jì)出各具特點(diǎn)的表達(dá)載體以獲得滿意的表達(dá)效果。

圖3 蛋白SDS-PAGE電泳M.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1.pColdⅠ空載體，全細(xì)胞；2.pColdⅠ空載體，上清液；3.pColdⅠ空載體，沉淀；4.EXP0347，全細(xì)胞；5.EXP0347，上清液；6.EXP0347，沉淀.

Chavagnat等[15]自Pseudomonasalginovora中克隆出編碼海藻酸裂解酶ALY(E.C 4.2.2.3)的基因，以pET-22b為載體在大腸桿菌中進(jìn)行過(guò)表達(dá)。Sawabe等[16]從PseudoalteromonaselyakoiiIAM 14594中，利用基因文庫(kù)方法自7000個(gè)轉(zhuǎn)化子中篩選到pTPA1、pTPB1、pTPC1和pTPD1 4個(gè)陽(yáng)性克隆子,再利用限制性酶切圖譜法找到編碼胞外海藻酸裂解酶基因的序列, 通過(guò)pTrcHisB質(zhì)粒表達(dá)載體在大腸桿菌中對(duì)此蛋白進(jìn)行表達(dá)。

而石莼多糖裂解酶作為一種新發(fā)現(xiàn)的綠藻膠酶，最初分離自可以降解藻類的海洋革蘭氏陰性細(xì)菌，且最近還可分離自土壤中的變形桿菌Ochrobactrumtritici[11]。之前在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有同源的序列，因此這是一種新的蛋白酶，在不同的環(huán)境中，降解細(xì)菌均能存在，且能利用石莼多糖為碳源來(lái)代謝，表明其具有廣泛的多樣性。但分離細(xì)菌的過(guò)程繁瑣，異地不一定可以篩選出該細(xì)菌，并且蛋白產(chǎn)量不高。如今，利用基因工程技術(shù)大量制備石莼多糖裂解酶已成為可能，尤其是近幾年，多糖裂解酶的異源表達(dá)逐漸增多，其中原核表達(dá)的報(bào)道較多。

3.2 原核表達(dá)結(jié)果分析

本試驗(yàn)構(gòu)建并比較兩種石莼多糖裂解酶原核表達(dá)方法。首先嘗試將石莼多糖裂解酶基因連接至質(zhì)粒載體pColdⅠ中，得到pColdⅠ-859載體，經(jīng)過(guò)酶切測(cè)序，獲得正確重組的質(zhì)粒。pCold系列載體為冷休克表達(dá)載體，利用大腸桿菌的低溫表達(dá)基因，在低溫下大腸桿菌暫停生長(zhǎng)，大部分基因表達(dá)量減少，但是冷休克表達(dá)載體可被誘導(dǎo)表達(dá)。并且可以解決表達(dá)蛋白不可溶的問(wèn)題。但上述載體轉(zhuǎn)化RP(DE3)后，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析顯示，目的蛋白未明顯表達(dá)。因此考慮重新選擇質(zhì)粒和受體菌。其次將石莼多糖裂解酶基因連接至pET-28a(+)中，pET-28a(+)質(zhì)粒載體系統(tǒng)是當(dāng)前表達(dá)重組蛋白最常用、功能最強(qiáng)大的載體之一，攜帶有卡那霉素抗性基因。pET-28a(+)載體5′端帶有一個(gè)His標(biāo)簽，便于蛋白篩選。試驗(yàn)中，載體構(gòu)建正確?；蛑亟M大腸桿菌經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白，通過(guò)Ni-NTA柱純化后，SDS-PAGE電泳顯示，71 ku(蛋白包含His標(biāo)簽，目的蛋白分子大小約為46 ku)分子量處有明顯蛋白條帶。再經(jīng)Western Blot分析，顯示單一條帶，分子量約為71 ku，為表達(dá)的石莼多糖裂解酶。Nyuall Collén等[11]也曾基因克隆出石莼多糖裂解酶的基因，利用pFO4作為質(zhì)粒載體，將目的基因插入到質(zhì)粒載體上，并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21細(xì)胞中，蛋白也得到了表達(dá)，但是它的表達(dá)水平很低。

本研究通過(guò)構(gòu)建比較原核表達(dá)系統(tǒng)經(jīng)特異性誘導(dǎo)表達(dá)重組石莼多糖裂解酶，通過(guò)多次試驗(yàn)，選擇了一個(gè)合適的原核表達(dá)體系，通過(guò)多次表達(dá)純化蛋白，目的蛋白的質(zhì)量濃度可由0.5 mg/mL提至1.0 mg/mL，該酶預(yù)期可降解石莼多糖并得到具有重要生物學(xué)功能的石莼寡糖，而該表達(dá)系統(tǒng)也可優(yōu)化放大，這些都將是后續(xù)研究的內(nèi)容，為進(jìn)一步研究該酶活性奠定了試驗(yàn)基礎(chǔ)。