鄒文慧，單鱗茜，韓 邦，駱 劍，齊 鑫，林浩然,

( 1.海南大學 海洋學院，南海海洋資源利用國家重點實驗室，熱帶生物資源教育部重點實驗室，海南 ?？?570228； 2.中山大學，水生經濟動物研究所，廣東省水生經濟動物良種繁育重點實驗室，廣東 廣州 510275 )

波紋唇魚(Cheilinusundulatus)為大型珊瑚礁魚類，屬硬骨魚綱、鱸形目、隆頭魚科、唇魚屬[1]，在我國主要分布于南海與東海南部，海南萬寧、陵水等海域以及香港、臺灣諸島。波紋唇魚存在天然的性逆轉現(xiàn)象，種群性別結構影響其性逆轉的發(fā)生[2]，在波紋唇魚野生群體中大部分成年個體都是雌魚，群體中少數(shù)體形較大、年齡較長的個體才發(fā)育為雄魚。此外，由于波紋唇魚顏色艷麗、體形巨大、肉質細嫩且營養(yǎng)價值高，其售價持續(xù)上漲[3]。在巨大的經濟利益驅使下，波紋唇魚野生資源遭到嚴重破壞，瀕臨滅絕。

雄激素在脊椎動物的性別分化、性成熟和精子發(fā)生中起重要作用[4]，其通過雄激素受體(ar)激活下游信號通路，從而行使其功能。雄激素受體屬于核受體超家族成員[5]，具有3個主要結構域，包括N端超變量轉錄激活結構域、高度保守的DNA結合區(qū)域和C端配體結合區(qū)域。小鼠(Musmusculus)中，突變雄激素受體基因產生對雄激素不敏感的表現(xiàn)型缺失[6-7]。據(jù)此，雄激素受體在雄性性別分化和發(fā)育過程中起重要作用。在魚類中，斑馬魚(Daniorerio)雄激素受體基因在精巢支持細胞中高度表達，而魚類的支持細胞與精原細胞的發(fā)育有關，這表明斑馬魚雄激素受體基因在精原細胞的增殖和分化中起重要作用。雄激素受體基因在鰻鱺(Anguillajaponica)精巢早期發(fā)育階段的高度表達也說明，雄激素受體在雄性魚類性別分化和發(fā)育過程中起重要的作用。有研究表明，雄激素受體拮抗劑氟他米處理成熟雄性黑頭呆魚(Pimephalespromelas)，引起抗苗勒氏管激素的表達下降，據(jù)此，可進一步說明雄激素受體在調節(jié)魚類精巢發(fā)育過程中發(fā)揮重要的作用。此外，雄激素受體在雌性生殖功能中也扮演著非常重要的角色。在鰻鱺卵巢中，雄激素11-KT的靶細胞主要是濾泡細胞和產卵層的上皮細胞，進而可以推測，雄激素作為卵子發(fā)生直接調控因子，通過雄激素受體在卵母細胞發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。在澳洲鰻鱺(A.australis)中，雄激素11-KT可以通過雄激素受體對卵黃卵母細胞的發(fā)育進行調控，從而刺激卵巢中甘油三酯的積累并增大卵母細胞的直徑[8]。

波紋唇魚作為性別分化研究的良好材料，又以肉質鮮美和較高的觀賞性而得到人們的青睞，所以具有很高的研究價值。并且，目前尚無人工繁殖的波紋唇魚，所以其人工繁殖研究非常重要。筆者以波紋唇魚為研究對象，首次克隆了雄激素受體基因的cDNA序列全長，并進行序列分析，與其他魚類雄激素受體基因氨基酸序列比對，并構建進化樹，Realtime PCR分析波紋唇魚雄激素受體基因mRNA在13種組織中的表達量，為進一步研究波紋唇魚內分泌生理奠定基礎，也為該魚生殖調控提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集及RNA提取

試驗所用的波紋唇魚取自海南三亞剛漁排網箱人工暫養(yǎng)的野生個體，共3尾2齡雌性，共2.7 kg。解剖，取前腦、中腦、后腦、垂體、下丘腦、卵巢、肝臟、心臟、脾臟、前腸、后腸、腎臟、肌肉13種組織，立即放入液氮中，用Trizol試劑(invitrogen公司)提取總RNA，提取的RNA通過瓊脂糖電泳進行鑒定后于冰箱-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 雄激素受體 cDNA的分子克隆

1.2.1 波紋唇魚雄激素受體基因核心區(qū)cDNA的克隆

取1 μg的性腺RNA，使用反轉錄試劑盒合成cDNA。根據(jù)波紋唇魚雄激素受體基因的轉錄組序列，用Primer 5.0軟件設計中間片段的引物ar-mid-F和ar-mid-R(表1)。以性腺cDNA為模板進行PCR擴增。反應體系為：10×Buffer 2 μL，dNTP 2 μL，cDNA 1 μL，Taq DNA polymerase 0.2 μL，ddH2O 12.8 μL，正反引物各1 μL。反應程序為：94 ℃預變性3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，共35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。純化目的片段、連接到PGEM-T載體，轉染大腸桿菌(Escherichiacoli)感受態(tài)細胞，菌液涂布于LB固體培養(yǎng)基上12 h后挑菌，驗證，測序，于美國國立生物技術信息中心網站上比對。

1.2.2 cDNA末端快速擴增

用SmartTM-race cDNA Amplification Kit合成可用于擴增3′和5′端SmartTM-race-ready cDNA。以核心區(qū)序列為模板設計5′RACE-PCR 和3′RACE-PCR 套式引物3′-ar-RACE-F1、3′-ar-RACE-F2、5′-ar-RACE-R1、5′-ar-RACE-R2，通用引物為UPM和NUP(表1)。反應體系及反應程序如上所述。純化目的片段、連接到PGEM-T載體，轉染大腸桿菌感受態(tài)細胞，菌液涂布于LB固體培養(yǎng)基上12 h后挑菌，驗證，測序，于美國國立生物技術信息中心網站上比對。

1.3 序列測定和分析

使用ORFFinder(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)尋找ORF；信號肽預測采用Sinnal P 4.1(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)；用SMART(http:∥smart.embl-heidelberg.de/)在線程序進行蛋白結構域分析；運用DNAstar軟件，將所得雄激素受體基因的cDNA序列轉化為氨基酸序列，與美國國立生物技術信息中心網站中的雄激素受體基因氨基酸資源進行系統(tǒng)發(fā)生分析，采用鄰接法(1000次運算)運用Mega 7.0軟件，進行多重比對，構建系統(tǒng)進化樹。

1.4 雄激素受體在波紋唇魚中的組織表達

取各組織1 μg，將其反轉錄為cDNA。利用Primer 5.0設計1對定量引物ar-real-F和ar-real-R以及內參引物βactin-real-F，βactin-real-R和EF1α-real-F，EF1α-real-R，引物序列見表1。將cDNA稀釋10倍，作為模板，進行熒光定量PCR，體系為：cDNA 0.5 μL，SYBR 5 μL，正反引物各0.2 μL，H2O 4.1 μL。

2 結 果

2.1 波紋唇魚雄激素受體基因的克隆及系統(tǒng)發(fā)生分析

利用RT-PCR擴增得到的雄激素受體基因的全長為3514 bp，其中包括111 bp的5′UTR，1104 bp的3′UTR(去除poly A尾)以及2268 bp的ORF。經BLAST比對，獲得的雄激素受體基因的片段與其他魚類的雄激素受體基因有很高的相似性，表明這段序列為波紋唇魚的雄激素受體基因序列。將所獲得的序列提交到美國國立生物技術信息中心，獲得登錄號為MG383647。

波紋唇魚雄激素受體基因cDNA編碼755個氨基酸，用Singal P程序分析發(fā)現(xiàn)無信號肽酶切位點，預測其蛋白分子量約為84.7 ku，等電點約為6.83。用BLASTP分析雄激素受體基因的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)它的3個結構域：轉錄激活區(qū)(TAD，AA1-393)、DNA結合結構域(DBD，AA394-475)和配體結合結構域(LBD，AA510-754)，進一步分析顯示該序列還含有大部分物種中均含有的P-box(GSCKV)和D-box(ASKND)特殊結構，其均位于DNA結合結構域，此外，在配體結合結構域區(qū)還有1個八肽的亮氨酸拉鏈區(qū)(圖1)。

表1 波紋唇魚雄激素受體基因克隆和表達所用的引物

采用BioEdit軟件進行多重序列比較分析發(fā)現(xiàn)，波紋唇魚雄激素受體基因的氨基酸序列在各物種之間的相似性較高，波紋唇魚雄激素受體基因與貝氏隆頭魚(Labrusbergylta)、西氏擬隆頭魚(Pseudolabrussieboldi)和歐洲舌齒鱸(Dicentrarchuslabrax)的雄激素受體基因的相似性分別為85.0%、82.5%和79.5%(表2)。將所得的雄激素受體基因序列與美國國立生物技術信息中心中16個物種的雄激素受體序列進行同源性比對，利用Mega 7.0軟件采用鄰接法和最大似然法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。兩種系統(tǒng)發(fā)育樹分析均表明，波紋唇魚與隆頭魚科魚類貝氏隆頭魚和西氏擬隆頭魚聚為一小支，與其他魚類聚為一大支，而哺乳類聚為一支(圖2～3)。各物種雄激素受體序列在GenBank的注冊號分別為：西氏擬隆頭魚(ADI24924.1)，歐洲舌齒鱸(AAT76433.1)，大黃魚(Pseudosciaenacrocea)(NP_001290296.1)，絨須石首魚(Micropogoniasundulatus)(AAU09477.1)，斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)(ADQ43815.1)，真鯛(Chrysophrysmajor)(AB017158.1)，金頭鯛(Sparusaurata)(AEO13404.1)，雀鯛(Stegastespartitus)(XP_008301461.1)，黑鯛(Acanthopagrusschlegelii)(AAO61694.1)，三刺魚(Gasterosteusaculeatus)(AB545869.1)，貝氏隆頭魚(XP_020485876.1)，人(Homosapiens)(M20132.1)，小鼠(NM_013476.4)，斑馬魚(NP_001076592.1)，尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)(NM_001279615.1)。

表2 波紋唇魚雄激素受體氨基酸序列與其他已知物種的雄激素受體基因氨基酸序相似性分析

2.2 組織表達分布

通過熒光定量PCR的方法檢測雄激素受體基因在波紋唇魚的前腦、中腦、后腦、垂體、下丘腦、心臟、肝臟、卵巢、脾臟、腎臟、前腸、后腸、肌肉13種組織中的表達量。結果表明，波紋唇魚雄激素受體基因在這13種組織中均有表達，在腎臟中表達量最高，而在前腸中的表達量最少(圖4)。

圖1 波紋唇魚雄激素受體基因的cDNA序列及推測的氨基酸序列第一段黑色部分為轉錄激活區(qū)，藍色部分為DNA結合域，紅色部分為配體結合域，黃色區(qū)域為P-box和D-box，綠色部分為八肽的亮氨酸拉鏈區(qū). 終止密碼子以*號表示.

圖2 16種動物雄激素受體基因mRNA序列鄰接法構建的系統(tǒng)進化樹

圖4 雄激素受體基因在波紋唇魚各組織中的表達

3 討 論

3.1 波紋唇魚雄激素受體基因的克隆及系統(tǒng)發(fā)生分析

本試驗克隆了波紋唇魚雄激素受體基因的全長cDNA序列，全長為3514 bp，其中包括111 bp的5′UTR，1104 bp的3′UTR(去除poly A尾)以及2268 bp的ORF，其蛋白分子量約為84.7 ku，等電點約為6.83。經BLAST對比，其與貝氏隆頭魚、西氏擬隆頭魚和歐洲舌齒鱸的雄激素受體基因的相似性分別為85.0%、82.5%和79.5%，可以確定其為波紋唇魚的雄激素受體基因。與其直系同源的雄激素受體相似，波紋唇魚雄激素受體的氨基酸序列同樣包含了3個特征結構域，即轉錄激活區(qū)，DNA結合域和配體結合域。轉錄激活區(qū)的低同源性被認為是構成許多直系同源雄激素受體基因主要結構差異的原因，同時也是導致不同組織分布的原因，為研究的重點[9]。高度保守的DNA結合域有2個鋅指結構[10]，這2個鋅指結構分別包含P-box(GSCKV)(參與雄激素受體與其配體反應元件的結合)以及D-box(ASKND)(參與識別反應元件half-sites的間距)。同源性較不保守的配體結合域呈螺旋狀結構，參與配體受體結合作用，在其C端末發(fā)現(xiàn)的亮氨酸拉鏈結構，對受體的二聚體化作用很重要[11]。序列分析表明，波紋唇魚雄激素受體基因的DNA結合域和配體結合域高度保守。

系統(tǒng)發(fā)育分析表明，魚類和哺乳類位于2個明顯不同的分支，克隆得到的波紋唇魚的雄激素受體基因位于魚類分支中，再次證明克隆得到的片段為波紋唇魚的雄激素受體基因。此外，一些魚類同時存在2種雄激素受體基因，推測其可能是全基因組復制—退化—補償過程所致[12]。即原始雄激素受體基因的復制推測起來可能發(fā)生在魚類第2次基因組復制(2R)時[13-15]，于是產生了雄激素受體α基因和雄激素受體β基因。在進化過程中，雄激素受體α基因或者雄激素受體β基因丟失。可能因為在長時間的進化中，其中1個基因會以特異性世系的方式丟失[16]。

3.2 波紋唇魚雄激素受體基因的組織分布

波紋唇魚雄激素受體基因在各組織中的熒光定量PCR結果表明，波紋唇魚的雄激素受體基因在各個組織中均有表達，只是表達量有差異，說明雄激素受體在波紋唇魚中具有廣泛的生理作用。波紋唇魚的雄激素受體基因在腎臟中表達量最高，而在前腸中的表達量最低。研究表明，含有2種雄激素受體基因亞型的魚類，其組織表達模式也存在很大的差異，如虹鱒(Oncorhynchusmykiss)，雄激素受體α基因在垂體、腦、卵巢、精巢、肝臟和心臟中均有表達，而雄激素受體β基因只在垂體、腦、精巢和卵巢中有表達，鰻鱺的雄激素受體α基因在脾臟、腎臟、心臟、肌肉、肝臟、精巢、卵巢和腦中有表達，但雄激素受體β基因只在肌肉、脾臟和精巢中有表達[17]。以上研究表明，雄激素受體α基因在許多組織中均有表達，只是表達量有差異，在一些重要組織中具有較高的表達水平，而雄激素受體β基因只在個別組織中表達。只含有1種雄激素受體基因的魚類存在相似的組織表達模式，即在各個組織中均有表達，如南方鲇(Silurusmeridionalis)在腦、垂體、鰓、心臟、肝臟、腸、脾臟、性腺、腎臟和肌肉中均有表達，其中雄魚在肝臟中表達量較高；對雄性半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)的研究發(fā)現(xiàn)，雄激素受體基因在各組織中均有表達，其中腎臟的表達量最高[18]。而波紋唇魚雄激素受體基因的表達模式與只含有1種雄激素受體基因魚類的表達模式相似，其中腎臟中表達量最高，推測其可能只含有1種雄激素受體基因。此外，波紋唇魚的雄激素受體基因在肝臟中的表達量較高，與之前的研究結果一致，提示魚類中的雄激素可能是通過性激素受體調控卵黃蛋白原的合成[19]。除此之外，波紋唇魚的雄激素受體基因在卵巢中的表達量也較高，說明雄激素受體在雌性的生殖功能中也起著重要的作用。