高聰 張宇 陳云飛 劉兵

(四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院 1.急診外科，2.肝膽外科，四川 成都 610072)

肝硬化是飲食、精神狀態(tài)及代謝性疾病等致病因素長期反復作用于肝臟導致的慢性肝損害，患者易并發(fā)膽囊結石。在我國，膽囊結石發(fā)病率約為10%，而肝硬化并發(fā)膽囊結石患者因全身狀況不佳不允許手術，藥物治療療效差或反復發(fā)作，因此預防肝硬化患者發(fā)生膽囊結石需從其病理方面深入研究[1-2]。膽汁中成分改變?yōu)槟懩医Y石形成的重要原因，當膽汁酸減少時，可直接或間接影響膽汁中膽固醇狀態(tài)，形成結石[3]。膽汁中膽汁酸、磷脂、直接膽紅素(Direct bilirubin,DBIL)等的分泌受法尼醇受體(FXR)、膽鹽輸出泵(BSEP)、多耐藥相關蛋白(MRP)的調節(jié)，其中FXR作為膽汁酸受體可調節(jié)膽汁酸合成、轉運、代謝及重吸收，減少膽汁淤積[4-5]。Wang YD等[6]的研究發(fā)現(xiàn)，肝臟細胞中的胞質為BSEP的儲存庫，其BSEP量為肝細胞膽管側膜的6倍，體內BSEP主要通過肝細胞膽管膜轉運膽鹽，而減少肝臟內膽汁潴留、瘀積，且FXR可調節(jié)BSEP、MRP活性[7]。因此，本研究在既往研究基礎上，推測FXR、BSEP、MRP引起的膽汁酸代謝異?？赡芘c肝硬化并發(fā)膽囊結石有關，旨在為預防肝硬化并發(fā)膽囊結石提供病理依據(jù)，現(xiàn)將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 納入2015年4月～2017年5月我院收治的肝硬化并發(fā)膽囊結石患者40例、單純膽囊結石患者36例。納入標準：①肝硬化患者依據(jù)肝炎病史及血清乙肝病毒感染標記陽性，且具有肝硬化臨床表現(xiàn)、生化與影像學輔助檢查證實為肝硬化，并于術中行肝臟活檢，病理證實為肝硬化。②所有患者均經(jīng)CT或腹部超聲明確有膽囊結石。③麻醉分級(ASA)Ⅰ～Ⅱ級，且同意術后留取標本并簽署知情同意書。排除標準：①梗阻性黃疸、合并膽總管結石、肝內膽管結石及其他膽道疾病者。②有肝切除術或膽道手術史。③合并全身免疫系統(tǒng)疾病或近1周服用過熊去氧膽酸、利膽藥者。將肝硬化并發(fā)膽囊結石患者納入研究組，單純膽囊結石患者納入對照組，研究組中男性18例，女性22例，年齡18～60歲，平均(38.56±4.11)歲，ASA分級：Ⅰ級21例，Ⅱ級19例；對照組中男性17例，女性19例，年齡19～58歲，平均(38.50±4.15)歲，ASA分級：Ⅰ級19例，Ⅱ級17例，兩組在性別、年齡、ASA分級等一般資料方面比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究征得我院醫(yī)學倫理委員會批準通過。

1.2 研究方法

1.2.1 術前檢查及標本采集 均于手術前1d抽血化驗生化全項目，統(tǒng)計其總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、總膽汁酸(TBA)，術中切取肝緣約1.0cm2肝組織，采集標本后立即保存于福爾馬林液中，并在24h內制成石蠟切片。

1.2.2 主要試劑及配制 兔抗人FXR多克隆抗體(濃縮型，工作液濃度1：100)，兔抗人BSEP多克隆抗體(濃縮型，工作液濃度1：100)，兔抗人MRP2多克隆抗體(濃縮型，工作液濃度1：80)，均購自北京奧森生物技術有限公司；SP試劑盒由北京中杉金橋生物技術有限公司提供；DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2.3 FXR、BSEP、MRP2表達水平測定 以4%多聚甲醛固定，銅制模具包埋組織塊，后切片、脫蠟、阻斷內源性過氧化物酶活性、抗原修復、甩去多余液體、滴加第一抗體、滴加生物素化第二抗體、滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液、DAB顯色、蘇木素復染細胞核7(8s，后置于×400倍顯微鏡下觀察。應用美國IMAge-Pro Plus v5.1軟件，捕獲顯微鏡采集的組織形態(tài)學圖片，選取其中陽性表達最強的5個視野進行計算，記錄陽性細胞數(shù)及陽性細胞顯色強度，得出SP評分(IHS)的數(shù)值。SP免疫組化圖像評分標準：①陽性細胞數(shù)分級：0.0%～1%計0分，1%～10%計1分，11%～50%計2分，51%～80%計4分，81%～100%計4分。②陽性細胞顯色強度：0分：未染黃色，陰性；1分：淡黃色，弱陽性；2分：黃色，陽性；3分：棕黃色，強陽性；IHS評分為①、②評分乘積。

1.3 觀察指標 ①對比兩組術前一天血清TBIL、DBIL、TC、TG、TBA水平。②比較兩組肝臟組織FXR、BSEP、MRP2表達水平。③分析上述指標相關性。

2 結果

2.1 兩組血清TBIL、DBIL、TC、TG、TBA水平比較 與對照組比較，研究組DBIL、TBA明顯較高，TC、TG較低(均P<0.05)，而TBIL對比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 兩組血清TBIL、DBIL、TC、TG、TBA水平比較Table 1 The levels of serum TBIL, DBIL, TC, TG and TBA in the two groups

2.2 兩組肝臟組織FXR、BSEP、MRP2表達水平比較 研究組肝臟組織FXR、BSEP、MRP2表達水平均明顯低于對照組(P<0.05)，見表2。

2.3 血清生化指標FXR、BSEP、MRP2相關性分析 結果顯示，肝硬化并發(fā)膽囊結石患者FXR、BSEP、MRP2與DBIL、TBA呈負相關，且FXR與BSEP、MRP2均存在正相關關系(P<0.05)，見表3。

Table2LivertissueFXR,BSEPandMRP2expressionlevelsinthetwogroups

組別nFXRBSEPMRP2研究組402.15±0.344.21±0.514.35±0.56對照組369.21±1.029.24±1.129.81±1.06t41.32525.61928.474P0.0000.0000.000

表3 血清生化指標FXR、BSEP、MRP2相關性分析Table 3 Correlation analysis of serum biochemical indexes, FXR, BSEP and MRP2

2.4 SP染色結果 研究組局部肝細胞水腫，脂肪變性，結締組織增生，炎細胞浸潤，主要定位于細胞質中，細胞核也有少量表達，且研究組FXR、BSEP、MRP2表達均低于對照組，見圖1～3。

圖1 研究組、對照組FXR SP染色(×400)Figure 1 FXR SP staining in the study group and control group (x400)注：a為研究組，b為對照組

圖2 研究組、對照組BSEP SP染色(×400)Figure 2 BSEP SP staining in the study group and control group (x400)注：a為研究組，b為對照組

圖3 研究組、對照組MRP2 SP染色(×400)Figure 3 MRP2 SP staining in the study group and control group (x400)注：a為研究組，b為對照組

3 討論

膽囊結石為臨床外科常見病，患者常因膽絞痛、急性膽囊炎而就診，嚴重者可出現(xiàn)膽囊壞疽、穿孔，膽囊結石一旦進入膽總管內，可致急性膽管炎、急性胰腺炎等，嚴重者危及生命[8]。膽囊結石的發(fā)生與肝硬化程度及病程密切相關，王子晨等[9]的調查結果顯示，肝硬化患者合并膽囊結石發(fā)生率為21.3%，明顯高于正常體檢者單純膽囊結石發(fā)生率的5.6%，且肝功能分級、DBIL、TG等是肝硬化并發(fā)膽囊結石的危險因素，因而探討肝硬化患者并發(fā)膽囊結石的發(fā)病機制有助于改善其肝功能，減少結石形成率[10]。膽汁酸為膽汁重要成分，經(jīng)肝臟合成后分泌至膽囊或腸道中，正常情況下膽汁中膽固醇、膽汁酸及磷脂維持一定比例的動態(tài)平衡，而肝硬化時，肝細胞受損，肝內酶不足，膽固醇向膽汁酸轉化減少，使膽汁酸分泌減少，膽汁酸的減少也會使膽固醇溶解降低，膽固醇從膽汁中析出結晶，形成膽固醇結石，同時膽汁酸也是膽紅素重要助溶劑，膽汁酸含量降低時將影響膽汁中游離膽紅素溶解度，使膽汁酸與鈣離子結合力減小，繼而形成膽色素結石，因此肝硬化患者膽汁中膽汁酸濃度的改變?yōu)槟懩医Y石形成創(chuàng)造了條件，對研究膽汁酸代謝異常機制有重要意義[11-12]。膽汁形成及分泌與肝細胞轉運蛋白密切相關，其中一些蛋白如轉運膽鹽的轉運子BSEP、MRP2等在膽囊結石形成中的作用已在動物實驗中得到充分印證[13-14]，但BSEP、MRP2與人體膽囊結石尤其是肝硬化并發(fā)膽囊結石的關系研究較少[15]。孔凡民等[16]的研究發(fā)現(xiàn)，膽囊結石患者的肝組織中BSEP、MRP2表達較正常肝組織減少，光密度平均值分別為(0.47±0.18)、(1.12±0.39)，提示BSEP、MRP2在人體膽囊結石形成中發(fā)揮作用。FXR則是主要表達于肝臟的典型核受體結構，DNA結合域與靶基因上FXR反應元件結合后發(fā)揮轉錄調節(jié)作用，其活化可負反饋調節(jié)膽汁酸合成，Liu J等[17]在分析膽汁酸對原代肝細胞膽汁酸合成和轉運基因表達的影響時發(fā)現(xiàn)，在膽汁酸限速酶存在時，F(xiàn)XR作為主要靶基因有增加趨勢，同時膽汁酸吸收轉運Na+牛磺膽酸共轉運多肽不受影響，而BSEP提高了15倍，MRP2也增加，可見FXR、BSEP、MRP2均可能參與膽汁酸代謝調控。

本次研究在既往研究基礎上，分析了肝硬化合并膽囊結石患者(研究組)、單純膽囊結石患者(對照組)在術前一天血清生化指標及FXR、BSEP、MRP2表達水平。結果顯示，研究組血清DBIL、TBA明顯高于對照組，而TC、TG明顯低于對照組，且研究組FXR、BSEP、MRP2均較對照組低，這與張亮亮等[18]的報道結果相近，證實肝硬化并發(fā)膽囊結石患者存在明顯的膽汁酸代謝異常。原因在于肝細胞血竇面基底膜上轉運蛋白，包括有機陰離子、BSEP、MRP2等轉運膽汁相應成分進入肝細胞內，再經(jīng)與蛋白質結合或細胞內擴散方式運輸至肝細胞毛細膽管膜，后進入毛細膽管內，形成膽汁；當肝硬化時，膽鹽超載，F(xiàn)XR參與肝細胞毛細膽管膜上MRP2轉錄的上調；FXR的活化還可誘導BSEP、MRP2表達，促進膽汁酸及DBIL分泌，調節(jié)膽汁成分；此外，在快速循環(huán)轉運過程中，BSEP可能通過降解磷酸化、糖基化、泛酸化等蛋白質修飾作用而保護自己，以避免被降解。同時因FXR的下調致BSEP、MRP2表達減少，肝臟分泌DBIL入膽汁的能力受損，使DBIL升高，血清生化檢測可觀察到TBIL、DBIL、TBA等異常[19]。國外學者Chen WD1等[20]的研究證實，F(xiàn)XR在膽酸激活下，通過與FXR形成異二聚體，繼而與BSEP及MRP2啟動子區(qū)的IR-1結合來調節(jié)基因轉錄。而本研究結果顯示，肝硬化合并膽囊結石患者FXR與BSEP、MRP2存在正相關性，進一步論證了FXR、BSEP及MRP2在膽汁酸代謝異常中的相互作用關系。

4 結論

本研究結果顯示，膽汁酸代謝異常是肝硬化患者并發(fā)膽囊結石的主要病理機制，可據(jù)此開展治療預防肝硬化并發(fā)膽囊結石。