金向東 何旭華 葉盛威 劉洋劉山

(1.鄂州市第三醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北 鄂州 436000；2.湖北省腫瘤醫(yī)院胃腸外科， 湖北 武漢 430000； 3.武漢市第三醫(yī)院胸外科，湖北 武漢 430000)

胃癌(Gastric Carcinoma)是世界上第四大常見的惡性腫瘤，是全球因癌癥導(dǎo)致死亡的第二大原因[1]。近年隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的進步，治療胃癌戰(zhàn)略更加多元化[2]。胃癌生長和轉(zhuǎn)移的過程相當復(fù)雜，涉及大量致癌基因、抑癌基因和非編碼基因等[3]。分子靶向治療的興起，對于胃癌患者而言是一個重要的福音[4]。

miRNA是一類小型非編碼RNA的家族，其長度范圍從20～22個核苷酸不等[5]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在調(diào)節(jié)多種生物過程中起重要作用，如細胞分化、增殖、遷移和凋亡[6-9]。許多miRNA可直接作用于致癌基因和抑癌基因，調(diào)控其表達，從而影響腫瘤細胞的生物學(xué)行為[10]。

Bcl-2(B-cell lymphoma 2)是人類Bcl-2基因編碼的蛋白質(zhì)，是調(diào)節(jié)細胞凋亡的Bcl-2家族的創(chuàng)始成員[11]。這是一個重要的抗凋亡蛋白[12]，但它并非屬于原癌基因，因為它并不是生長信號傳感器[13]。盡管存在部分相應(yīng)的研究基礎(chǔ)，但在胃癌中miR-16和Bcl-2的相互關(guān)系及其調(diào)節(jié)機制仍然不清楚。在本研究中，我們通過探尋miR-16在胃癌SGC7901細胞中的表達及其與Bcl-2作用的分子機制，為胃癌的潛在治療靶點提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng) 胃癌細胞系SGC7901購自中國科學(xué)院(中國北京)，用含有10%的胎牛血清(Thermo Fisher Scientific，Inc)的RPMI-1640培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，加入100μg / ml青霉素和100μg/ ml鏈霉素(上海遠慕生物科技有限公司)，加濕，在37℃下含有5%的二氧化碳(CO2)中培養(yǎng)。

1.2 細胞轉(zhuǎn)染 miR-16 mimic、inhibitor和Bcl-2靶向siRNA在上海艾博思生物技術(shù)有限公司合成。將SGC7901細胞接種于6孔板中，并在37℃、95%空氣和5%CO2的潮濕空氣中培養(yǎng)過夜，使其融合度達到70%～90%。隨后根據(jù) Lipofectamine 3000試劑(Invitrogen，Carlsbad，California，United States)操作步驟進行轉(zhuǎn)染。

1.3 細胞活性評估 通過細胞計數(shù)試劑盒-8(CCK-8，Dojindo Molecular Technologies，Gaithersburg，MD)評估細胞活力。將SGC7901細胞懸液接種在96孔板中，在37℃、5%CO2中預(yù)培養(yǎng)24h。用miR-16 mimic、miR-16 inhibitor、Bcl-2 siRNA模擬對照和抑制劑對照轉(zhuǎn)染。48h后向培養(yǎng)基中加入10μlCCK-8溶液，培養(yǎng)物在37℃、5%CO2中孵育1h。使用酶標儀(Bio-Rad，Hercules，CA)在450nm處測量吸光度。

1.4 RNA提取和定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) 用Trizol Reagent(Invitrogen)法對轉(zhuǎn)染的細胞進行RNA提取。使用PrimeScript RT試劑盒(TaKaRa，中國大連)，將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用SYBR Premix ExTaq TaKaRa與Stratagene Mx3000P PCR系統(tǒng)(Agilent Technologies，Inc，Santa Clara，CA，USA)進行定量PCR。GAPDH用作mRNA定量的內(nèi)參。 通過2-ΔΔCT方法計算mRNA的相對表達率。每個基因重復(fù)反應(yīng)3次。進行獨立實驗3次。

1.5 Western blotting 使用Radio Immunoprecipitation Assay(RIPA)裂解緩沖液(Beyotime Biotechnology，Shanghai，China)提取蛋白質(zhì)，裂解液中加入蛋白酶抑制劑(Roche，Basle，Switzerland)。使用BCA TM蛋白質(zhì)測定試劑盒(Pierce，Appleton，WI，USA)對蛋白質(zhì)進行定量檢測。將等量的蛋白質(zhì)進行凝膠(10%～12%SDS-PAGE)電泳，使用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)染至PVDF(Maibio，Shanghai，China)膜上，使用5%脫脂奶粉室溫下封閉2h以上。并用以下一抗Bcl-2(ab32124)、pro-caspase-3 (ab32150)、cleaved caspase-3(ab13585)、pro-caspase-9 (ab32068)、GAPDH(ab8245, Abcam, Cambridge, UK) and cleaved caspase-9 (#9501; Cell signaling Technology)進行4℃孵育過夜。然后與二抗(1：5000，Abcam，USA)標記通過辣根過氧化物酶在室溫下培養(yǎng)1h，漂洗后，ECL發(fā)光。實驗重復(fù)3次。

1.6 細胞凋亡實驗 細胞凋亡采用FITC膜聯(lián)蛋白V凋亡檢測試劑盒(北京中國生物技術(shù)研究所)。將miR轉(zhuǎn)染的細胞再用PBS洗滌兩次，然后用5μl PI和10μl FITCAnnexin V中染色，在黑暗中37℃室溫中孵育1h。最后使用流式細胞儀FACS進行分析。

1.7 劃痕實驗 將胃癌SGC7901細胞接種于6孔板，待細胞融合度達到90%時，用已滅菌消毒的200μl槍頭垂直劃線，并在顯微鏡下測量劃痕的初始位置及距離(0 time)后置于恒溫孵箱中孵育72h，再次測量劃痕的距離，并計算細胞的遷移率。細胞遷移率的計算公式=[遷移距離D(0h)-遷移距離D(72h)]/ 遷移距離D(0h)。實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 miR-16在胃癌SGC7901細胞中的轉(zhuǎn)染效率 為確定miR-16是否參與胃癌腫瘤的發(fā)生，將miR-16mimic、miR-16inhibitor及其相應(yīng)的對照分別轉(zhuǎn)染入SGC7901細胞。通過PCR檢測轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果顯示，miR-16 mimic組表達明顯上調(diào)[(1.01±0.14)%vs(1.89±0.23)%，P<0.01]，而miR-16 inhibitor組顯著下調(diào)[(1.06±0.15)%vs(0.28±0.11)%，P<0.01]，見圖1。

2.2 miR-16對SGC7901細胞遷移和活性的影響 通過CCK-8劃痕實驗測定miR-16在SGC7901細胞上的生物學(xué)功能。miR-16過表達時SGC7901細胞的活性[(103.4±8.5)% vs(72.4±10.4)%，P<0.05]和相對遷移率[(98.8±10.8)% vs(67.6±11.5)%，P<0.05]遠低于對照組。而細胞活性 [(98.6±9.70) % vs(121.2±11.1)%，P<0.05]和相對遷移率[(104.5±11.0%)% vs(120.5±11.6)%，P<0.05]在miR-16 inhibitor組則高于對照組，表明miR-16能抑制SGC7901細胞遷移和活性,見圖2A、B。

2.3 miR-16對SGC7901細胞凋亡的影響 在miR-16過表達時，SGC7901細胞凋亡百分比顯著增加[(3.2±0.7)% vs(11.3±1.3)%，P<0.001]，而miR-16下調(diào)時對細胞凋亡沒有明顯影響[(3.3±0.3)% vs(3.5±0.9)%，P>0.05]，見圖3A。進行western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白表達，結(jié)果顯示，miR-16 mimic激活凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3和cleaved caspase-3的表達，而miR-16抑制時這些蛋白表達卻相反,且pro-caspase-3和procaspase-9的蛋白水平未被miR-16過表達或抑制所調(diào)控，見圖3 B。這些結(jié)果表明，miR-16可能是潛在的胃癌抑制基因，能誘導(dǎo)胃癌細胞SGC7901的凋亡。

圖1miR-16mimic，miR-16inhibitor及其相應(yīng)的對照轉(zhuǎn)染入SGC7901細胞后miR-16的表達情況

Figure1TheexpressionofmiR-16mimic,miR-16inhibitoranditscorrespondingcontroltransfectedSGC7901cells

注：與mimic、inhibitor比較，①P<0.01

圖2 miR-16mimic、miR-16inhibitor及其相應(yīng)的對照對細胞遷移和活性影響Figure 2 Effect of miR-16mimic, miR-16 inhibitor and their corresponding controls on cell migration and activity

注：與mimic、inhibior比較，①P<0.05

圖3 miR-16 對SGC7901細胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白的影響Figure 3 Effect of miR-16 on apoptotic cells rate and apoptosis-related proteins of SGC7901注：與mimic比較，①P<0.01

2.4 miR-16對Bcl-2表達的影響 為進一步探索miR-16在胃癌SGC7901細胞中對Bcl-2調(diào)控的影響，將miR-16mimic、miR-16inhibitor及其相應(yīng)的對照轉(zhuǎn)染入SGC7901細胞，通過western blot檢測Bcl-2蛋白水平。結(jié)果表明，miR-16過表達后Bcl-2的表達明顯下調(diào)，而miR-16抑制后Bcl-2明顯上調(diào)，見圖4。故推測在胃癌中Bcl-2受到miR-16負性調(diào)節(jié)。

圖4miR-16mimic，miR-16inhibitor對Bcl-2蛋白表達的影響

Figure4EffectofmiR-16mimicandmiR-16inhibitoronBcl-2proteinexpression

2.5 Bcl-2對SGC7901細胞遷移和活性的影響 為進一步驗證Bcl-2是否參與miR-16對SGC7901細胞的調(diào)控，通過使用Bcl-2特異性siRNA用于沉默Bcl-2后與miR-16 inhibitor進行共同轉(zhuǎn)染。結(jié)果顯示，miR-16inhibitor轉(zhuǎn)染后SGC7901的細胞活性[(103.5±9.3)% vs(126.7±10.6)%，P<0.05]和遷移 [(100.1±10.4)% vs(132.3±11.9)%，P<0.05] 顯著增加，而與Bcl-2 siRNA共轉(zhuǎn)染后可以消除miR-16 inhibitor對細胞活性[(126.7±10.6)% vs(74.3±8.3)%，P<0.01]和遷移[(132.3±11.9)% vs(80.6±12.1)%，P<0.01]的促進作用，見圖5。說明Bcl-2能消除miR-16對SGC7901細胞遷移和活性的影響，反向驗證了miR-16對Bcl-2的調(diào)控作用。

圖5 Bcl-2 siRNA與miR-16inhibitor共轉(zhuǎn)后對SGC7901細胞遷移和活性的影響Figure 5 The migration and activity after Bcl-2 siRNA co-transfection with miR-16 inhibitor on SGC7901 cell 注：A.與inhibitor、inhibitor+si-Bcl-2比較，①P<0.05；B.與inhibitor control、inhibitor+si-Bcl-2比較，②P<0.001

2.6 Bcl-2對SGC7901細胞凋亡的影響 結(jié)果顯示，miR-16 inhibitor與Bcl-2 siRNA共轉(zhuǎn)染后，凋亡細胞明顯增加[(3.4±0.5)% vs(12.2±0.9)%，P<0.001]，見圖6A。western blot分析結(jié)果顯示，與miR-16inhibitor相比，miR-16inhibitor與Bcl-2siRNA共轉(zhuǎn)染后會活化cleaved caspase-3和cleaved caspase-3的表達，但pro-caspase-3和procaspase-9的蛋白水平無明顯變化。這些結(jié)果表明，Bcl-2可改變miR-16對SGC7901細胞凋亡的影響，見圖6B。

圖6 Bcl-2 siRNA與miR-16inhibitor共轉(zhuǎn)后對SGC7901細胞凋亡的影響Figure 6 The effect of apoptosis after Bcl-2 siRNA co-transfection with miR-16 inhibitor on SGC79013注：與inhibitor +si-Bcl-2比較，①P<0.01

3 討論

對于胃癌患者而言，特別是晚期患者，傳統(tǒng)的二聯(lián)或三聯(lián)細胞毒性化療方案的中位生存期約為9～11個月[14]。雖然聯(lián)合化療較單藥化療能一定程度上提高腫瘤緩解率和總體生存率，但聯(lián)合用藥也顯著增加化療的毒性[15]。來自基因表達譜的數(shù)據(jù)表明，胃癌的病理和臨床表現(xiàn)的差異可能是由于獨特的分子表型所導(dǎo)致的[16]。近些年來，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)了胃癌的各類分子靶向藥物，并應(yīng)用于治療中，包括靶向HER2、EGFR、MET、FGFR、PI3K / MTOR和血管生成通路的藥物[17]。例如，用曲妥珠單抗治療HER2陽性的胃癌已經(jīng)導(dǎo)致總體存活率的顯著增加[18]。與傳統(tǒng)的治療模式相比，這些新的靶向分子能顯著提高患者的生存獲益。

目前越來越多的證據(jù)表明，非編碼miRNA可能參與腫瘤的發(fā)病機制，其功能和潛在應(yīng)用已成為目前研究熱點[19]。miR-16與人類癌癥相關(guān)，包括乳腺癌、結(jié)腸直腸腺癌、肺癌等[20-22]發(fā)病和發(fā)展有關(guān)。有研究表明，miR-16能通過在非小細胞肺癌細胞中激活自噬來抑制TGF-β1誘導(dǎo)的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[23]。還有研究表明，miR-16還能通過抑制癌基因BMI1誘導(dǎo)乳腺癌細胞中的線粒體依賴性細胞凋亡[24]。但是miR-16在胃癌中的作用機制，以及對胃癌細胞的增殖、遷移和凋亡的影響尚未得到深入的研究。在本研究中我們證明了miR-16的過表達抑制胃癌SGC7901細胞的活力和遷移，并促進細胞凋亡，起到抑癌的作用。這也印證了文獻中miR-16的作用方式。

Bcl-2基因在細胞存活和凋亡抑制中起關(guān)鍵作用。許多研究已經(jīng)表明，Bcl-2可以被幾種miRNA調(diào)控。目前已經(jīng)確定Bcl-2基因的損傷導(dǎo)致了多種惡性腫瘤的發(fā)生，包括黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌、慢性淋巴細胞白血病和肺癌等[25-29]。XU等研究發(fā)現(xiàn)，MicroRNA-19a能抑制鼻咽癌CNE1細胞活力和遷移，而且是通過抑制Bcl-2而誘導(dǎo)細胞凋亡[30]。SHEN等在體外證明，miR-16通過體外靶向Bcl-2誘導(dǎo)大鼠活化的胰腺星狀細胞凋亡[31]。然而沒有足夠的信息證明miR-16調(diào)節(jié)Bcl-2在胃癌中的作用。因此，我們的研究首次揭示了在胃癌中miR-16和Bcl-2之間的潛在關(guān)系。實驗結(jié)果證明，miR-16能抑制Bcl-2蛋白的表達。此外，Bcl-2的沉默可以消除miR-16抑制對細胞活性和遷移的促進作用，并可促進細胞的凋亡，而Bcl-2在胃癌SGC7901中被miR-16反向調(diào)節(jié)。

4 結(jié)論

本研究表明，miR-16能抑制細胞活性和遷移，誘導(dǎo)胃癌SGC7901細胞凋亡，因此miR-16可能是潛在的胃癌抑制基因。此外，miR-16可能通過靶向調(diào)控Bcl-2發(fā)揮對SGC7901細胞的作用。這些結(jié)果提示miR-16在治療胃癌中發(fā)揮一定作用，可能是潛在的胃癌抑制基因，有望成為下一個治療胃癌的新靶點。