王 陽(yáng)，曹志華，牛桂林，劉 磊，朱 清，胡躍世，李 征

(南陽(yáng)市中心醫(yī)院泌尿外科，河南南陽(yáng) 473000)

前列腺癌是歐美地區(qū)男性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，也是導(dǎo)致發(fā)達(dá)國(guó)家男性癌癥相關(guān)死亡的重要原因。近年來(lái)，前列腺癌在中國(guó)的發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)[1-2]。因前列腺癌發(fā)病部位隱匿，大部分患者確診時(shí)已發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，喪失手術(shù)良機(jī)，而長(zhǎng)期抗雄激素治療則導(dǎo)致前列腺癌由雄激素敏感性逐漸進(jìn)展為去勢(shì)抵抗性，預(yù)后極差?；蛑委熍c分子靶向治療是目前新興起的癌癥治療方法[3]。紡錘體和動(dòng)粒相關(guān)蛋白1(spindle and kinetochore associated protein 1，SKA1)與SKA2、SKA3共同構(gòu)成三元復(fù)合物SKA，是動(dòng)粒與微管蛋白結(jié)合所必需的成分。SKA復(fù)合物在真核生物的有絲分裂過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，為真核生物生長(zhǎng)、發(fā)育的基礎(chǔ)。多項(xiàng)研究顯示[4-6]，SKA1在腫瘤生長(zhǎng)過程中發(fā)揮重要作用，SKA1沉默可影響非小細(xì)胞肺癌、肝細(xì)胞癌、胃癌等多種癌細(xì)胞的惡性增殖，抑制其周期進(jìn)程。但SKA1與前列腺癌的相關(guān)性研究鮮有報(bào)道。本研究通過慢病毒載體介導(dǎo)的RNAi技術(shù)來(lái)沉默前列腺癌PC-3細(xì)胞中SKA1的表達(dá)，觀察其對(duì)PC-3細(xì)胞增殖以及細(xì)胞周期進(jìn)程的影響，探討其治療前列腺癌的潛在價(jià)值。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株與試劑去勢(shì)抵抗性前列腺癌PC-3細(xì)胞以及人類胚胎腎細(xì)胞系293T購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)(上海，中國(guó)；慢病毒載體pLVTHM購(gòu)自武漢淼靈生物公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶和胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；PCR引物購(gòu)自上海生工公司；轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自北京博邁斯生物公司；Trizol總RNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自寶生物大連公司；兔多克隆抗體SKA1、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4(cyclin-dependent protein kinases 4，CDK4)、cyclinD1購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；羊抗兔IgG-HRP購(gòu)自上海碧云天生物公司；噻唑藍(lán)(MTT)試劑盒購(gòu)自上海歌凡生物公司；MX-3000P熒光定量PCR儀和EPICSXL流式細(xì)胞儀購(gòu)自Beckman Couhe公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及傳代取適量PC-3細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液(含100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素)中，放置在37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，每3 d傳代1次，一般傳至3～5代，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞可用于轉(zhuǎn)染。293T細(xì)胞在Dulbecco改良的含10%FBS的Eagle’s培養(yǎng)基(Hyclone)中孵育，置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。

1.3慢病毒表達(dá)載體Lv-shSKA1的構(gòu)建、包裝及滴度測(cè)定根據(jù)GenBank提供的人SKA1 基因的mRNA序列(NM_001039535)，利用siRNA設(shè)計(jì)軟件(http：//jura．wi．mit．Edu/bioc/siRNAext/home．Php)設(shè)計(jì)3條siRNA序列，根據(jù)抑制效率，確定抑制效率最高的SKA1序列，添加EcoRⅠ、XmaⅠ酶切位點(diǎn)，其siRNA引物序列為：上游5′-GGCTggatccATGGCCTCGTCAGATCTGGAAC-3′，下游為5′-AAGGCCCGGGGGTTATAACATAACGAGTAAGT-3′，引物序列由上海生工公司合成。用EcoRⅠ、XmaⅠ雙酶切慢病毒載體pLVTHM，用T4連接酶將SKA1目的片段與慢病毒表達(dá)載體連接，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 DH5α。篩選陽(yáng)性克隆，抽提質(zhì)粒，進(jìn)行PCR鑒定，然后送往上海生工進(jìn)行測(cè)序。將重組質(zhì)粒及慢病毒包裝質(zhì)粒用Lipofectami 共同轉(zhuǎn)染至293T 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染8 h后，棄去含有質(zhì)粒的培養(yǎng)基，換成完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集上清液，離心，過濾，并進(jìn)行滴度測(cè)定。

1.4慢病毒轉(zhuǎn)染PC-3細(xì)胞取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC-3細(xì)胞，接種于6孔板，每孔約5×104個(gè)細(xì)胞，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%～80%時(shí)開始轉(zhuǎn)染，操作步驟參照轉(zhuǎn)染試劑盒說明書。將PC-3細(xì)胞分別與含20 μL Lv-shSKA1慢病毒或Lv-shCon的轉(zhuǎn)染試劑共培養(yǎng)4 d后，熒光顯微鏡下檢測(cè)GFP表達(dá)，評(píng)估感染效率。

1.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)轉(zhuǎn)染4 d后，收集各組(空白組、Lv-shCon組和Lv-shSKA1組)PC-3細(xì)胞，利用Trizol法提取RNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，并用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其純度及濃度。取1.0 μg總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。取5 μL稀釋20倍的cDNA為模板，加入10 μL SYBR Green qPCR Super Mix(2×)、0.4 μL ROX Reference DyeⅡ(50×)、0.5 μL上下游引物，最后加ddH2O至20 μL，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95 ℃ 45 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，以GAPDH作為內(nèi)參基因。采用2-ΔΔCt法分析qRT-PCR結(jié)果，ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因；ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)組- ΔCt對(duì)照組。siRNA干涉效率=(2-ΔΔCt目的基因-2-ΔΔCt內(nèi)參基因) / 2-ΔΔCt目的基因× 100%。引物序列見表1。

表1 SKA1和GAPDH引物序列

1.6蛋白質(zhì)印跡(Westernblot) 轉(zhuǎn)染4 d后，收集各組(空白組、Lv-shCon組和Lv-shSKA1組)PC-3細(xì)胞，按常規(guī)步驟提取細(xì)胞蛋白，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量，并調(diào)節(jié)好蛋白濃度。每組取50 μg蛋白樣品，與適量上樣緩沖液混合，煮沸變性；SDS-PAGE電泳；轉(zhuǎn)至PVDF膜，置于含5%脫脂奶粉的TBST溶液，避光封閉1 h；TBST漂洗后，將膜置于一抗稀釋液(兔多克隆抗體SKA1、CDK4、cyclin D1按1∶1 000稀釋)中，4 ℃孵育過夜；次晨TBST漂洗后，置于二抗稀釋液(山羊抗兔IgG溶液按1∶1 000稀釋)中，室溫孵育1 h，TBST漂洗3遍；將發(fā)光液均勻加在膜上，反應(yīng)5 min，置于暗盒中曝光、顯影和定影。使用GIS-2020數(shù)碼圖像分析系統(tǒng)掃描并分析蛋白雜交條帶。以GAPDH作為內(nèi)參蛋白。

1.7MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖收集各組慢病毒干擾5 d的PC-3細(xì)胞，按每孔1.0×105個(gè)細(xì)胞接種至96孔培養(yǎng)板，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。在37℃、5%CO2孵箱中分別繼續(xù)培養(yǎng)1、2、3、4和5 d。培養(yǎng)終止前4 h每孔加入20 μL MTT液(5 mg/mL，用PBS溶解)，在37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，小心棄去上清，向每孔加入150 μL DMSO，振蕩溶解結(jié)晶。采用酶標(biāo)分析儀在595 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的吸光度(A595)值。

1.8流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期收集各組慢病毒干擾5 d的PC-3細(xì)胞，按每孔1.0×105個(gè)細(xì)胞接種至6 cm培養(yǎng)皿，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。待細(xì)胞覆蓋率達(dá)80%時(shí)，棄掉培養(yǎng)液，收集細(xì)胞；D-Hanks漂洗1遍，胰酶消化后終止，收集細(xì)胞；4 ℃預(yù)冷PBS漂洗1遍，收集細(xì)胞；100 μL PBS重懸細(xì)胞，用900 μL 4 ℃預(yù)冷70%乙醇4 ℃固定1 h；棄掉固定液，PBS漂洗，加入20 μL PI染色液，4 ℃避光孵育30 min；PBS漂洗，過濾，用EPICSXL流式細(xì)胞儀進(jìn)行數(shù)據(jù)采集并分析。

2 結(jié) 果

2.1慢病毒轉(zhuǎn)染后PC-3細(xì)胞的形態(tài)觀察感染72 h后，熒光顯微鏡檢測(cè)Lv-shSKA1慢病毒感染PC-3細(xì)胞情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Lv-shCon組和Lv-shSKA1組細(xì)胞GFP陽(yáng)性率均達(dá)80%以上，說明重組慢病毒Lv-shSKA1對(duì)PC-3細(xì)胞具有較好的親嗜性(圖1)。

圖1熒光顯微鏡觀察慢病毒轉(zhuǎn)染后PC-3細(xì)胞形態(tài)(×10)

Bright：明場(chǎng)視野；GFP：綠色熒光視野。

2.2轉(zhuǎn)染PC-3細(xì)胞SKA1mRNA表達(dá)水平qRT-PCR結(jié)果顯示，SKA1 mRNA在空白組與Lv-shCon組細(xì)胞中的表達(dá)水平差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與Lv-shCon組比較，SKA1 mRNA在Lv-shSKA1組細(xì)胞中表達(dá)水平顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,表2)。

2.3轉(zhuǎn)染PC-3細(xì)胞SKA1蛋白表達(dá)水平Western blot結(jié)果顯示，SKA1蛋白在空白組與Lv-shCon組細(xì)胞中的表達(dá)水平差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與Lv-shCon組比較，SKA1蛋白在Lv-shSKA1組細(xì)胞中表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05，圖2、表2)。

表2 慢病毒轉(zhuǎn)染PC-3細(xì)胞后SKA1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平及相對(duì)灰度值

表2 慢病毒轉(zhuǎn)染PC-3細(xì)胞后SKA1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平及相對(duì)灰度值

組別SKA1(2-ΔΔCt)水平SKA1灰度空白組1.03±0.130.407±0.018Lv-shCon組0.98±0.210.396±0.011Lv-shSKA1組0.26±0.07?0.294±0.038?F值42.25330.828P值0.000 0.000

與Lv-shCon組比較，*P<0.05。

圖2 慢病毒轉(zhuǎn)染PC-3細(xì)胞后SKA1蛋白表達(dá)

2.4慢病毒轉(zhuǎn)染對(duì)PC-3細(xì)胞增殖的影響MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，空白組與Lv-shCon組細(xì)胞增殖速率差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與Lv-shCon組比較，Lv-shSKA1組細(xì)胞增殖速率顯著較慢(P<0.05，表3)。

表3 慢病毒轉(zhuǎn)染PC-3細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)的A595值

表3 慢病毒轉(zhuǎn)染PC-3細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)的A595值

組別1 d2 d3 d4 d5 d空白組0.324±0.0050.510±0.0080.592±0.0210.872±0.0241.196±0.023Lv-shCon組0.322±0.0070.502±0.0120.576±0.0180.865±0.0211.184±0.018Lv-shSKA1組0.325±0.0040.501±0.0060.516±0.017?0.587±0.015?0.580±0.012?F值0.3891.49622.846319.159166.640P值0.6860.2630.0000.0000.000

與Lv-shCon組比較，*P<0.05。

2.5慢病毒轉(zhuǎn)染對(duì)PC-3細(xì)胞周期分布的影響流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，與Lv-shCon組比較，Lv-shSKA1組G0/G1期細(xì)胞數(shù)顯著減少(P<0.05)，S期細(xì)胞數(shù)顯著增加(P<0.05)，大部分細(xì)胞停滯于S期(表4)。

表4 慢病毒轉(zhuǎn)染PC-3細(xì)胞后各組G0/G1、S、G2/M、sub-G1所占百分比

表4 慢病毒轉(zhuǎn)染PC-3細(xì)胞后各組G0/G1、S、G2/M、sub-G1所占百分比

組別G0/G1SG2/M空白組61.73±1.5829.61±2.5811.53±1.08Lv-shCon組60.46±0.9631.58±0.8612.11±0.73Lv-shSKA1組48.84±1.68?39.36±1.49?12.81±0.52F值121.30241.4603.128P值0.0000.0000.081

與Lv-shCon組比較，*P<0.05。

2.6慢病毒轉(zhuǎn)染對(duì)PC-3細(xì)胞CDK4、cyclinD1蛋白表達(dá)的影響Western blot結(jié)果顯示，與Lv-shCon組比較，Lv-shSKA1組細(xì)胞CDK4、cyclin D1蛋白表達(dá)水平均顯著下調(diào)(P<0.05，圖3、表5)。

表5 慢病毒轉(zhuǎn)染PC-3細(xì)胞后CDK4、cyclin D1蛋白表達(dá)相對(duì)灰度值

表5 慢病毒轉(zhuǎn)染PC-3細(xì)胞后CDK4、cyclin D1蛋白表達(dá)相對(duì)灰度值

組別CDK4cyclinD1空白組0.431±0.0260.413±0.014Lv-shCon組0.425±0.0180.406±0.024Lv-shSKA1組0.305±0.015?0.312±0.021?F值61.861 39.336P值0.0000.000

與Lv-shCon組比較，*P<0.05。

圖3 慢病毒轉(zhuǎn)染PC-3細(xì)胞后CDK4、cyclinD1蛋白表達(dá)

3 討 論

前列腺癌早期患者主要以根治性手術(shù)切除為主，中晚期患者則以內(nèi)分泌治療-雄激素剝奪療法(androgen deprivation therapy，ADT)為主。治療初期，ADT治療對(duì)多數(shù)患者效果明顯，但隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)，多數(shù)患者均會(huì)進(jìn)展成去勢(shì)抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer,CRPC)，縮短患者生存期[7-8]。因此，探索CRPC的分子發(fā)生機(jī)制，尋找其關(guān)鍵作用靶點(diǎn)，將為靶向治療提供新的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。PC3細(xì)胞株是一種從人前列腺癌骨轉(zhuǎn)移腫瘤中分離出來(lái)的雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞株，目前被廣泛用于去勢(shì)抵抗型前列腺癌的基礎(chǔ)和臨床研究[9]。近年來(lái)，RNA干擾技術(shù)成為廣泛用于研究腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移及細(xì)胞周期的一種分子生物學(xué)工具，用于腫瘤的基因靶向治療具有極大的臨床應(yīng)用前景。本研究中我們應(yīng)用慢病毒介導(dǎo)的RNAi抑制SKA1在前列腺癌PC-3細(xì)胞中的表達(dá)，初步研究其在前列腺癌中的功能和作用，為后期的靶向治療提供理論依據(jù)。

紡錘體和動(dòng)粒相關(guān)蛋白1(SKA1)是近期發(fā)現(xiàn)的、與有絲分裂密切相關(guān)的基因，是動(dòng)粒結(jié)合微管蛋白必不可少的組成部分，其表達(dá)異?？稍斐杉忓N體檢測(cè)點(diǎn)發(fā)生缺陷，在細(xì)胞周期調(diào)控和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。SKA1在乳頭狀甲狀腺癌、非小細(xì)胞肺癌、肝細(xì)胞癌、胃癌、腎癌、前列腺癌等多種癌組織中的表達(dá)均顯著癌旁正常組織，與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、侵襲等密切相關(guān)，參與了相關(guān)腫瘤的細(xì)胞增殖進(jìn)程[ 10-12]。然而SKA1與前列腺癌的相關(guān)性研究鮮有報(bào)道，是否也發(fā)揮類似作用，尚不得而知。本研究中我們采用shRNA干擾技術(shù)下調(diào)SKA1表達(dá)，并應(yīng)用MTT檢測(cè)SKA1下調(diào)對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示，Lv-shSKA1組細(xì)胞增殖速率慢于Lv-shCon組，說明慢病毒介導(dǎo)的SKA1沉默能夠抑制前列腺癌PC-3細(xì)胞的體外增殖，與他人研究結(jié)果類似[ 13-14]，提示SKA1在前列腺癌增殖過程中也發(fā)揮重要作用。

細(xì)胞周期失控是腫瘤形成的關(guān)鍵因素。SKA1是一種重要的微管結(jié)合蛋白，與SKA2、SKA3組成蛋白復(fù)合物SKA，對(duì)微管蛋白的解聚起著調(diào)控作用，使染色體移向兩級(jí)，保證細(xì)胞順利進(jìn)行有絲分裂，防止產(chǎn)生非整倍體。細(xì)胞增殖過程中非整倍體的產(chǎn)生是絕大部分惡性腫瘤的共同特征[15-16]。SKA1缺乏可造成染色體分離異常，而過表達(dá)則可造成細(xì)胞間期微管成核，其缺乏或過表達(dá)均對(duì)有絲分裂的正常進(jìn)程造成嚴(yán)重影響。SKA復(fù)合物或其成分缺乏可造成染色體排列不整齊或延遲，導(dǎo)致有絲分裂在分裂中期停滯，而不能進(jìn)入分裂后期[17-18]。學(xué)者研究顯示，SKA1缺乏使胃癌MGC80-3細(xì)胞周期阻滯在S期，進(jìn)而抑制增殖[19]。本研究中我們的研究結(jié)果與其一致，流式檢測(cè)結(jié)果顯示，SKA1基因沉默后G0/G1期細(xì)胞數(shù)顯著減少，S期細(xì)胞數(shù)顯著增加，即大量細(xì)胞在S期停滯，表明SKA1能夠影響細(xì)胞的周期分布，可能是造成腫瘤細(xì)胞惡性增殖的一個(gè)重要原因，SKA1有望成為治療前列腺癌的靶標(biāo)基因。

迄今為止，SKA1沉默抑制腫瘤細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程的的分子機(jī)制尚不明確，因此，我們進(jìn)一步研究SKA1沉默對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的影響。CDK4、cyclin D1是影響腫瘤細(xì)胞周期進(jìn)程的2個(gè)關(guān)鍵調(diào)控分子，cyclin D1是G1期的細(xì)胞周期蛋白，與CDK4在G1期結(jié)合成復(fù)合物，接著在氨基端與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤編碼蛋白pRb結(jié)合并使其磷酸化，釋放出轉(zhuǎn)錄因子E2F，調(diào)控細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，對(duì)細(xì)胞的分裂增殖起著促進(jìn)作用[20-21]。本研究中我們的結(jié)果顯示，，SKA1基因表達(dá)沉默后，前列腺癌PC-3細(xì)胞中CDK4、cyclin D1蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，這與QIN等[5]在肝癌中的研究結(jié)果類似，因此，我們有理由推測(cè)SKA1敲低后抑制前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制可能部分通過下調(diào)CDK4和Cyclin D1的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

總之，這些研究結(jié)果表明SKA1可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白在前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)中發(fā)揮重要作用，慢病毒介導(dǎo)的SKA1 沉默將會(huì)和其他分子標(biāo)志物一樣成為治療前列腺癌的新的治療策略。不過本研究只是對(duì)SKA1在前列腺癌中的功能及下游調(diào)控蛋白進(jìn)行初步研究，研究層面尚淺，后續(xù)還需繼續(xù)從機(jī)制上進(jìn)行深入研究。