張團(tuán)結(jié)， 任 敏

(安徽省醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院普外科乳腺外科， 安徽 合肥 230022)

乳腺癌是我國(guó)女性最為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，近年來(lái)，其發(fā)病率和病死率逐漸呈年輕化和上升的趨勢(shì)[1]。很多乳腺癌患者在初診時(shí)就已經(jīng)發(fā)生大量的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，同時(shí)相當(dāng)一部分乳腺癌具有較高的侵襲性；從乳腺癌致死的眾多臨床病例觀察來(lái)看，乳腺癌患者并非死于原位腫瘤，而是死于惡性腫瘤的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移[2-4]；而乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和侵襲是由多個(gè)基因和多條信號(hào)通路相互作用、相互協(xié)調(diào)參與的復(fù)雜生理過(guò)程[5]，因此，對(duì)乳腺癌的發(fā)病機(jī)制及早期診斷研究具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)通路與腫瘤信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控有關(guān)[6-7]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路密切參與調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌、前列腺癌和卵巢癌等腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，主要作用是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增值、分化和轉(zhuǎn)移[8]，但有關(guān)Wnt/β-catenin信號(hào)通路在乳腺癌發(fā)病機(jī)制中的研究較少。有研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌MCF-7細(xì)胞系中，Wnt1反義RNA可以誘導(dǎo)凋亡并引起下游蛋白表達(dá)水平的變化，在Wnt1轉(zhuǎn)基因小鼠腫瘤模型中，Wnt1信號(hào)的減弱導(dǎo)致小鼠乳腺癌腫瘤消退及肺臟轉(zhuǎn)移延遲[9]。腫瘤細(xì)胞在細(xì)胞漿和細(xì)胞核內(nèi)的β-catenin異常積聚最常見(jiàn)，是惡性腫瘤中的普遍事件，在結(jié)、直腸腺瘤及結(jié)、直腸癌中均發(fā)現(xiàn)β-catenin的異常表達(dá)，已證明其與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)[10]。因此，本研究將選取我院于2015年1月～2017年1月間收治的150例乳腺癌患者和乳腺癌MCF-7細(xì)胞作為研究對(duì)象，檢測(cè)乳腺癌組織和細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白Wnt-1和β-catenin的表達(dá)，為今后通過(guò)阻斷Wnt/β-catenin信號(hào)通路為措施的乳腺癌靶向治療提供了有效的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

資 料 和 方 法

1 臨床資料

選取2015年1月～2017年1月間我院收治的150例乳腺癌患者作為研究對(duì)象，納入標(biāo)準(zhǔn)為：(1)臨床病理檢查證實(shí)為乳腺癌；(2)患者均未經(jīng)任何藥物治療。排除標(biāo)準(zhǔn)為：(1)合并慢性感染性疾病，惡性腫瘤病史者；(2)心、肺、肝或腎功能嚴(yán)重?fù)p傷或障礙患者；(3)合并心理精神疾病或不能積極配合治療的患者。150例乳腺癌的腫瘤組織樣本來(lái)源于手術(shù)切除的臨床病理資料保存完整的乳腺癌石蠟切塊；非腫瘤組織樣本取自相應(yīng)的臨近0.5～1 cm乳腺腫瘤組織的癌旁組織。本研究通過(guò)我院倫理委員會(huì)審核，所有患者在治療前均知情同意并簽署同意書。

2 儀器和試劑

二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購(gòu)自Sigma；高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶均購(gòu)自Gibco；抗Wnt-1和 β-catenin抗體、Wnt/β-catenin信號(hào)通路激動(dòng)劑Wnt3a和拮抗劑DKK1均購(gòu)自Abcam； II 抗購(gòu)自碧云天公司；免疫組化檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；TRIzol試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR擴(kuò)增試劑盒均購(gòu)于TaRaKa。高速冷凍離心機(jī)(TGL-16G-A型)購(gòu)于上海安亭科學(xué)儀器廠；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(7300型)購(gòu)于Applied Biosystems；基礎(chǔ)電泳儀(Bio1645050)購(gòu)于Bio-Rad； 電子天平(EL204)購(gòu)于上海特勒-托多利多儀器有限公司。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1細(xì)胞培養(yǎng) 乳腺癌細(xì)胞株MCF-7購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)于高糖DMEM完全培養(yǎng)液中(含 10% 胎牛血清、 100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素)，置于 5% CO2、 37 ℃條件下的培養(yǎng)箱中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，隔天進(jìn)行換液。

3.2Real-time PCR檢測(cè)乳腺癌患者腫瘤組織和MCF-7細(xì)胞中Wnt-1和β-catenin的mRNA表達(dá)水平 根據(jù)TRIzol法提取乳腺癌組織總RNA，對(duì)RNA純度和濃度使用核酸測(cè)定儀進(jìn)行測(cè)定，取1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA并進(jìn)行定量檢測(cè)，Wnt-1、β-catenin及GAPDH(內(nèi)參照)的擴(kuò)增條件及計(jì)算方法參考文獻(xiàn)[8]。Wnt-1的上游引物序列為5’-CTGCAGAGCATGGACTCGTC-3’， 下游引物序列為5’-CCGTTGAAGAGAGTGGAGTG-3’； β-catenin的上游引物序列為5’-TACTCACGCCTCGAAACCT-3’， 下游引物序列為5’-GTCTGCTTTCCTCCCTGATG-3’； GAPDH的上游引物序列為5’-CCTAGTTCGTCATGGGTGTGAACCA-3，下游引物序列為5’-GCCAGTAGAGGCAGGGATGATGTTC-3。

用含10%胎生血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)MCF-7乳腺癌細(xì)胞。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞(5×106/L)接種于6孔板，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分組：(1)陰性對(duì)照(control)組：乳腺癌MCF-7細(xì)胞+DMEM高糖完全培養(yǎng)液(含10% FBS)；(2)激動(dòng)劑(agonist)組：乳腺癌MCF-7細(xì)胞+Wnt3a(1 mg/L)；(3)拮抗劑(antagonist)組：乳腺癌MCF-7細(xì)胞+DKK1 (16 μmol/L)。Real-time PCR檢測(cè)乳腺癌MCF-7細(xì)胞中Wnt-1和β-catenin的mRNA表達(dá)水平，具體引物設(shè)計(jì)以及實(shí)驗(yàn)操作同上。

3.3Western blot檢測(cè)乳腺癌組織和細(xì)胞中Wnt-1和β-catenin蛋白的表達(dá)水平 常規(guī)方法提取乳腺癌組織的總蛋白，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)方法測(cè)定蛋白濃度和含量后確保每孔上樣量為20 μg，進(jìn)行SDS-PAGE并轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)薄膜，脫脂奶(3%)封閉條帶2 h，分別4 ℃過(guò)夜孵育 I 抗，隔天用TBST洗膜，孵育 II 抗后用顯色液顯色。采用Quantity One軟件對(duì)條帶亮度進(jìn)行分析。MCF-7細(xì)胞Wnt-1和β-catenin的蛋白表達(dá)水平檢測(cè)方法大致相同。

3.4免疫組化檢測(cè)乳腺癌組織Wnt-1和β-catenin蛋白的表達(dá)水平 采用常規(guī)石蠟包埋方法制備石蠟切片(每張5 μm)，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，在pH 6.0檸檬酸鹽緩沖液(10 mmol/L)中介導(dǎo)抗原復(fù)性，進(jìn)行熱激持續(xù)30 min，分別采用抗Wnt-1和β-catenin單克隆抗體進(jìn)行切片組織孵育，4 ℃過(guò)夜。PBS洗滌后，孵育 II 抗并顯色曝光。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件。兩組間計(jì)量資料使用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較；多組間計(jì)量資料使用方差分析進(jìn)行比較，組間計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)分析進(jìn)行比較。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 乳腺癌患者腫瘤組織Wnt-1和β-catenin的表達(dá)水平結(jié)果

乳腫瘤組織Wnt-1和β-catenin mRNA和蛋白表達(dá)量均高于癌旁組織(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

Figure 1.The expression of Wnt-1 and β-catenin at mRNA (A) and protein (B) levels detected by real-time PCR and Western blot. Mean±SD. *P<0.05 vs paracancerous tissue.

2 Wnt-1和β-catenin表達(dá)與乳腺癌患者臨床病理學(xué)特征關(guān)系的分析

乳腺癌患者腫瘤組織Wnt-1陽(yáng)性率26.00%(39/150)高于癌旁組織Wnt-1陽(yáng)性率8.67%(13/150)(P<0.05)；乳腺癌患者腫瘤組織β-catenin陽(yáng)性率24.67%(37/150)高于癌旁組織β-catenin陽(yáng)性率8.00%(12/150)(P<0.05)。統(tǒng)計(jì)分析證實(shí)，Wnt-1表達(dá)與乳腺癌患者腫瘤轉(zhuǎn)移、腫瘤分期及腫瘤直徑密切相關(guān)(P<0.05)；β-catenin表達(dá)與乳腺癌患者腫瘤轉(zhuǎn)移和腫瘤分期密切相關(guān)(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 乳腺癌患者Wnt-1和β-catenin表達(dá)與患者臨床病理學(xué)特征關(guān)系分析

3 乳腺癌MCF-7細(xì)胞Wnt-1和β-catenin的表達(dá)水平

與NC組相比，激動(dòng)劑組Wnt-1和β-catenin的mRNA和蛋白表達(dá)量升高(P<0.05)；與control組相比，拮抗劑組Wnt-1和β-catenin的mRNA和蛋白表達(dá)量降低(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

Figure 2.The expression of Wnt-1 and β-catenin detected by real-time PCR (A) and Western blot (B). Mean±SD. n= 3.*P<0.05 vs control group.

討 論

本文旨在探討乳腺癌組織和細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)通路中Wnt-1和β-catenin表達(dá)情況及其監(jiān)測(cè)的臨床意義。Jang等[11]研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌干細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)水平要高于實(shí)質(zhì)腫瘤細(xì)胞,通過(guò)抑制該信號(hào)通路可阻止乳腺癌干細(xì)胞和實(shí)質(zhì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，如視黃酸受體應(yīng)答蛋白3[12]，干擾巢蛋白的表達(dá)[13]，可抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路，證明Wnt/β-catenin通路的活化狀態(tài)與乳腺癌干細(xì)胞的異常分化程度呈正相關(guān)。Choi等[14]實(shí)驗(yàn)證實(shí)抑制乳腺癌的小鼠模型中Wnt1的表達(dá)可減少腫瘤干細(xì)胞的富集。而β-catenin蛋白是一種多功能的細(xì)胞漿蛋白質(zhì)，在疾病狀態(tài)下，由于體內(nèi)環(huán)境的變化，游離的β-catenin蛋白進(jìn)入細(xì)胞核，參與調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)。另外，乳腺癌組織中存在著異常Wnt通路，β-catenin在乳腺癌中異常表達(dá)，且β-catenin的異常表達(dá)與腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。在超過(guò)60%的乳腺癌癌細(xì)胞的核和/或胞漿觀察到β-catenin的積累，并與預(yù)后不良相關(guān)[15-16]。

本研究首先通過(guò)對(duì)乳腺癌組織中Wnt-1和β-catenin的mRNA表達(dá)水平蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，乳腺癌患者腫瘤組織中Wnt-1和β-catenin mRNA和蛋白表達(dá)量高于癌旁組織，說(shuō)明了蛋白與基因水平的一致性。與各種腫瘤相關(guān)的β-catenin復(fù)合物和下游信號(hào)分子組分的其它突變常常導(dǎo)致β-catenin的相似異常穩(wěn)定和WNT靶基因在沒(méi)有刺激的情況下的不適當(dāng)表達(dá)[17]。這與本研究中癌組織β-catenin和Wnt-1表達(dá)量高于癌旁和正常組織的結(jié)果一致。我們更進(jìn)一步分析了Wnt-1和β-catenin表達(dá)與乳腺癌患者臨床病理學(xué)特征關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，乳腺癌患者腫瘤組織中Wnt-1陽(yáng)性率和β-catenin陽(yáng)性率高于癌旁組織Wnt-1陽(yáng)性率和β-catenin陽(yáng)性率，上述2種實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示乳腺癌與Wnt/β-catenin信號(hào)通路的正相關(guān)性。有研究顯示β-catenin可負(fù)向調(diào)節(jié)IRF3向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而抑制細(xì)胞的先天免疫反應(yīng)[20]。本研究還在細(xì)胞水平通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路激動(dòng)劑Wnt3a和拮抗劑DKK1細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，從正面和反面表明乳腺癌細(xì)胞中Wnt-1和β-catenin在Wnt/β-catenin信號(hào)通路中呈過(guò)表達(dá)狀態(tài)。這暗示了乳腺癌細(xì)胞中的先天免疫系統(tǒng)受到β-catenin過(guò)表達(dá)的抑制，這可能是腫瘤的發(fā)生和發(fā)展的重要因素。除此之外，β-catenin蛋白的不斷積累提示，可能包括Wnt升高對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路以及β-catenin降解障礙導(dǎo)致胞漿內(nèi)游離的β-catenin聚集并與TCF/LEF結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，啟動(dòng)下游基因轉(zhuǎn)錄，誘發(fā)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的異常改變。

綜上所述，深入解析Wnt/β-catenin信號(hào)通路可對(duì)乳腺癌發(fā)生機(jī)制和侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程，有利于為今后通過(guò)阻斷Wnt/β-catenin信號(hào)通路上相關(guān)靶點(diǎn)蛋白以治療乳腺癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。