蕭自智 ，施 紅 ，饒煥文 ，羅麗芬

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建 福州 350122；2.羅麗芬集團(tuán)嘉文麗化妝品技術(shù)中心，福建 漳州 363000）

我國(guó)糖尿病人數(shù)已達(dá) 1.096億，居全球首位，其中 2 型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）占90%～95%［1］。而 T2DM患者中非酒精性脂肪肝（non-alcohol fatty liver disease，NAFLD）的患病率為60%～80%［2］。T2DM合并NAFLD是一種代謝性疾病，往往與患者高脂高糖飲食有關(guān)［3］。高脂高糖飲食可以引起生物體內(nèi)高活性分子如活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生過(guò)多或消除減少，Kupffer細(xì)胞被激活并釋放大量炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1 等［4］，導(dǎo)致肝組織細(xì)胞損傷［5］。選定由石斛、黃芪、知母、生地黃、丹參、地龍、葛根、五味子等組成滋陰清熱、益氣生津、活血化瘀的石斛合劑1方，選定由茵陳、梔子、大黃、萹蓄、滑石、甘草等組成清瀉濁毒的石斛合劑2方，臨床上先以石斛合劑1方，繼以石斛合劑2方，隨之再返回1方，如此循環(huán)，形成石斛合劑序貫法（the dendrobium mixture in order cycle method，DMOC），并且發(fā)現(xiàn) DMOC 治療T2DM合并NAFLD療效較好，但是對(duì)其作用機(jī)制研究較少。為此，本研究通過(guò)構(gòu)建高成模率和高穩(wěn)定性的糖尿病大鼠模型，探討DMOC治療糖尿病合并肝損傷的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 40只健康清潔級(jí)雄性Sprague-Dawley 大鼠［許可證號(hào)：SCXK（滬）2012—0002］，5周齡，體質(zhì)量（180±10）g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供。大鼠飼養(yǎng)條件為12 h白晝、12 h黑夜自動(dòng)光照控制25℃、相對(duì)濕度55%的室溫控制，給予自來(lái)水及標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類飼料自由飲水及進(jìn)食，經(jīng)1周的適應(yīng)期后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。大鼠飼料成分由國(guó)外動(dòng)物飼料Dyets公司提供（見(jiàn)表 1、2），動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過(guò)臺(tái)灣弘光科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物照護(hù)及使用委員會(huì)審查（同意書(shū)編號(hào)10405，計(jì)劃執(zhí)行期間2015年9月—2016年8月）。

表1 大鼠飼料成分組成g／kg

表2 大鼠飼料能量組成Kcal／g

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 DMOC 1方（石斛15 g，黃芪21 g，知母 12 g，生地黃 15 g，丹參 18 g，地龍 15 g，葛根15 g，五味子 9 g，共計(jì) 120 g）、DMOC 2 方（茵陳 18 g，梔子 12 g，大黃 6 g，萹蓄 15 g，滑石 15 g，甘草 6 g，共計(jì)72 g）購(gòu)自福建中醫(yī)藥大學(xué)附設(shè)國(guó)醫(yī)堂。DMOC 1方和DMOC 2方均以常規(guī)水煎2次后合并、過(guò)濾、濃縮成 100 mL藥液，DMOC 1、2方的含藥量分別為 1.2、0.72 g／mL。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（美國(guó) Sigma公司）；ELx800酶標(biāo)儀（美國(guó) Bio-TEK公司）；55I尼康生物顯微鏡（日本尼康公司）；DSC-N158A臺(tái)式離心機(jī)（臺(tái)灣歐米克斯公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物模型的建立與干預(yù) 采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分成正常組、正常干預(yù)組、模型組和模型干預(yù)組，每組10只。正常組和正常干預(yù)組予以基本飼料喂養(yǎng)。模型組和模型干預(yù)組予以高脂高糖飼料喂養(yǎng) 4 周后，以腹腔注射 2 次 STZ 25 mg／（kg·m2），間隔72 h加以誘導(dǎo)，注射后第4天，用血糖測(cè)定儀測(cè)量血糖，篩選空腹血糖＞11.1 mmol／L為糖尿病造模成功大鼠。飲食處理后出現(xiàn)高血糖、高血脂、肝功能異常現(xiàn)象，表明糖尿病合并肝損傷大鼠造模成功。喂養(yǎng)至第36～44周，正常干預(yù)組和模型干預(yù)組進(jìn)行DMOC中藥干預(yù)。根據(jù)體重計(jì)算灌胃量，每只實(shí)驗(yàn)大鼠的灌胃量參考文獻(xiàn)［6］進(jìn)行換算，臨床上成人 1 包 ／（60 kg·d），每包100 mL，相當(dāng)于大鼠 0.05包／（0.5 kg·d），每包 5 mL。

2.2 組織取材與處理 實(shí)驗(yàn)期間大鼠進(jìn)行采血檢驗(yàn)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)束以二氧化碳對(duì)大鼠施行安樂(lè)死，組織取材保存于-80℃?zhèn)溆貌⑦M(jìn)行肝活檢。

2.3 觀測(cè)指標(biāo)及方法 觀察每組大鼠的體質(zhì)量、肝組織重量、腹腔脂肪重量。葡萄糖氧化酶法檢測(cè)空腹血糖（FBG）；紫外分光比色法檢測(cè) TC、TG、AST、ALT；DCF法檢測(cè)活性氧簇（ROS）；酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)TNF-α、IL-6；HE染色法觀察肝臟組織形態(tài)學(xué)變化。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（s）表示，采用單因素方差分析。

3 結(jié) 果

3.1 4組大鼠體質(zhì)量、肝組織重量、腹腔脂肪重量比較 見(jiàn)表3。

表3 4組大鼠體質(zhì)量、肝組織重量、腹腔脂肪重量比較（s）

表3 4組大鼠體質(zhì)量、肝組織重量、腹腔脂肪重量比較（s）

注：與正常組比較，1） P＜0.01，2） P＜0.05；與模型組比較，3） P＜0.01，4） P＜0.05。

腹腔脂肪重量／g 36.99±4.80 28.17±2.80 93.90±21.401）73.30±16.004）組別正常組正常干預(yù)組模型組模型干預(yù)組n 10 10 10 10體質(zhì)量／g 626.00±50.10 586.70±31.50 781.70±114.901）654.80±51.304）肝組織重量／g 16.11±2.00 16.24±2.90 19.08±2.402）16.05±1.303）

3.2 4組大鼠血清血糖、血脂、肝功能指標(biāo)比較見(jiàn)表4。

表4 4組大鼠血清血糖、血脂、肝功能指標(biāo)比較（±s）

表4 4組大鼠血清血糖、血脂、肝功能指標(biāo)比較（±s）

注：與正常組比較，1） P＜0.01；與模型組比較，2） P＜0.01，3） P＜0.05。

TG／（mmol／L）1.06±0.21 1.03±0.23 1.83±0.531）1.18±0.232）組別正常組正常干預(yù)組模型組模型干預(yù)組n 10 10 10 10 FBG／（mmol／L）5.25±0.12 4.63±1.91 14.99±3.951）9.57±2.872）TC／（mmol／L）1.83±0.35 2.06±0.41 2.82±0.551）2.26±0.233）AST ／（U／L）83.67±5.20 83.13±19.80 145.00±34.661）103.00±22.413）ALT／（U／L）35.50±10.33 37.63±14.04 113.33±37.451）91.29±13.88

3.3 大鼠肝組織形態(tài)學(xué)觀察 正常組與正常干預(yù)組肝細(xì)胞大小均勻，肝小葉結(jié)構(gòu)正常且肝索排列整齊，表明DMOC本身不會(huì)造成肝細(xì)胞毒性。模型組肝細(xì)胞呈空泡狀變性，肝組織脂肪堆積明顯，細(xì)胞間質(zhì)增厚，纖維組織增粗，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞明顯，中央靜脈周圍伴匯管區(qū)有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等情形；與模型組相比，模型干預(yù)組肝細(xì)胞壞死、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度明顯減少，表明DMOC具有改善糖尿病大鼠肝損傷的作用。見(jiàn)圖1。

圖1 4組大鼠肝組織HE染色圖（×200）

3.4 4組大鼠血清ROS、TNF-α、IL-6變化比較見(jiàn)表5。

表 5 4 組大鼠血清 ROS、TNF-α、IL-6 變化比較（s）

表 5 4 組大鼠血清 ROS、TNF-α、IL-6 變化比較（s）

注：與正常組比較，1） P＜0.01；與模型組比較，2） P＜0.01。

IL-6／（pg／mL）95.80±12.41 91.57±8.73 1906.07±211.171）592.11±5.762）組別正常組正常干預(yù)組模型組模型干預(yù)組n 10 10 10 10 ROS ／（nmol DCF ／min ／mg protein）51.48±5.52 52.65±7.14 357.75±50.591）165.70±22.972）TNF-α／（ng／mL）6.40±0.84 6.46±0.88 118.13±11.111）54.83±5.372）

4 討論

T2DM發(fā)生胰島素抵抗導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)沉積，從而促進(jìn)NAFLD的發(fā)生。以氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過(guò)氧化為中心的“二次打擊”學(xué)說(shuō)認(rèn)為：當(dāng)脂肪細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生超過(guò)抗氧化系統(tǒng)的清除能力時(shí)，便產(chǎn)生氧化應(yīng)激引起ROS產(chǎn)生，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，致使Kupffer細(xì)胞激活并釋放 TNF-α、IL-6、IL-1等炎性細(xì)胞因子和遞質(zhì)，進(jìn)而引起細(xì)胞浸潤(rùn)、變性或壞死，最終造成肝損傷形成NAFLD。

糖尿病合并脂肪肝的大鼠造模是一種雙疾病動(dòng)物模型，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者利用大鼠建立糖尿病合并脂肪肝的病理模型進(jìn)行大量研究［7］。本課題組基于脂肪肝造模的優(yōu)缺點(diǎn)，最后決定采用雄性SD大鼠造模，實(shí)驗(yàn)時(shí)間延長(zhǎng)為36周以符合人類30歲的年齡［8］，高脂高糖飲食的成分組成參考國(guó)外動(dòng)物飼料Dyets公司配方，模型組脂肪和總能量的實(shí)際攝入量明顯高于正常組，并在預(yù)實(shí)驗(yàn)36周后活檢觀察到肝損傷后再進(jìn)行中藥干預(yù)。

在動(dòng)物模型的研究中，血糖是觀察糖尿病和藥物治療的最主要指標(biāo)。血脂分析的重要指標(biāo)TC是指血液中脂蛋白所含膽固醇的總和，TG是人體主要的能量?jī)?chǔ)存單元，生命活力的重要來(lái)源，血清中持續(xù)的高濃度TG可導(dǎo)致肝細(xì)胞中脂肪過(guò)度堆積而引起脂肪肝病變。血清AST、ALT是肝細(xì)胞重要的酶，AST、ALT及AST／ALT比值是糖尿病合并脂肪肝的相對(duì)敏感指標(biāo)，可反映肝纖維化、肝硬化的發(fā)展。正常完整的肝細(xì)胞膜中AST及ALT不會(huì)溢流到肝細(xì)胞外，但肝細(xì)胞本身受到某些因素的傷害后，使得肝細(xì)胞中所含的AST及ALT釋放到血液中呈異常增加。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)：大鼠予以高脂高糖飲食后，內(nèi)臟的脂肪細(xì)胞增生肥大可誘導(dǎo)肝臟炎性浸潤(rùn)反應(yīng)、脂肪變性壞死及肝纖維化，同時(shí)K upffer細(xì)胞釋放大量炎性因子TNF-α、IL-6，隨著病變的進(jìn)展，炎性細(xì)胞和巨噬細(xì)胞將在肝細(xì)胞內(nèi)不斷增加，促進(jìn)肝細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，ROS產(chǎn)生過(guò)多或消除減少，從而促進(jìn)肝星狀細(xì)胞激活、轉(zhuǎn)化和合成細(xì)胞外基質(zhì)，最終誘發(fā)進(jìn)展性肝纖維化或肝細(xì)胞凋亡。檢測(cè)ROS、TNF-α、IL-6水平可以用來(lái)判斷糖尿病合并肝損傷的嚴(yán)重程度。

臨床經(jīng)驗(yàn)中用于治療T2DM合并NAFLD的中藥少見(jiàn)。石斛合劑序貫法是根據(jù)施紅教授［9］提出的“糖尿病氣陰兩虛血瘀貫穿始終，伴階段性痰、濕、熱以及濁毒不祛，氣陰難補(bǔ)”的觀點(diǎn)，根據(jù)滋陰清熱、益氣生津、活血化瘀、清瀉濁毒治則對(duì)糖尿病及其并發(fā)癥進(jìn)行治療，DMOC包含2個(gè)方劑（1方、2方），臨床上先以DMOC 1方滋陰清熱、益氣活血、補(bǔ)益脾腎，并隨證加減，扶正為主，7劑左右；繼以DMOC 2方清肝利濕泄?jié)幔?劑，中病即止；隨之再返回1方，如此循環(huán)，臨床應(yīng)用效果較好。本文的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明：石斛合劑能改善糖尿病合并肝損傷大鼠的 FBG、TC、TG、AST、ROS、TNF-α、IL-6，以及改善大鼠的肝組織泡沫樣變、細(xì)胞腫脹、界線不清、肝竇狹窄、中央靜脈周圍伴匯管區(qū)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。此外，為了觀察石斛合劑是否對(duì)肝臟具有毒性作用，本文在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上增設(shè)了正常干預(yù)組，結(jié)果顯示在肝功能及肝活檢方面，石斛合劑不具肝細(xì)胞毒性。關(guān)于石斛合劑序貫法治療糖尿病合并肝損傷大鼠的具體機(jī)制及安全性有待進(jìn)一步研究。