郭愛萍，黨 源 ，彭 軍

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122；2.南京軍區(qū)福州總醫(yī)院，福建 福州 350025）

黃芩苷是從植物黃芩的干燥根中提取的一種黃酮類化合物，化學(xué)式C21H18O11，分子量446.35，為一個帶有葡萄糖醛酸結(jié)構(gòu)的黃酮衍生物，是黃芩主要的有效成分之一。它具有多種的藥理作用，包括抗菌、抗病毒、抗腫瘤、清除氧自由基抗氧化、抗血管增殖等［1-2］。本文通過研究黃芩苷對人肺癌細(xì)胞A549增殖、遷移的影響，探討黃芩苷是否通過調(diào)控Cx43蛋白來抑制A549細(xì)胞的作用及其可能的作用機(jī)制，為黃芩苷在腫瘤治療中的應(yīng)用提供進(jìn)一步實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗細(xì)胞 人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.2 實驗試劑與儀器 黃芩苷（純度：99.1%，福州沃森生物技術(shù)有限公司）；DMEM培養(yǎng)基、胰酶消化液（美國GIBCO公司）；超級胎牛血清（四季青微生物材料工程公司）；辣根過氧化酶標(biāo)記的抗兔二抗、兔抗β－actin多克隆抗體（美國 Santa Cruz公司）；兔抗Cx43多克隆抗體（美國Abcam公司）；CKX41型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；Powerwave XS型酶標(biāo)儀（中國基因有限公司）；ChemiDoc MP成像系統(tǒng)（Bio-Rad，Hercules，CA）。

2 實驗方法

2.1 黃芩苷溶液配制 采用二甲亞砜（DMSO）將黃芩苷配制成 100 mmol／L的貯存液，－20℃保存?zhèn)溆茫R用時以DMEM培養(yǎng)基稀釋。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及干預(yù) 將A549細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%FBS的高糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)傳代。實驗分組：對照組（0 μmol／L 組）、50 μmol／L 組、100 μmol／L組、200 μmol／L 組。

2.3 CCK8檢測細(xì)胞增殖 取96孔板，將生長對數(shù)期A549細(xì)胞按104個／孔濃度接種，每孔約100μL細(xì)胞懸液，每組設(shè)置6個復(fù)孔，邊緣孔用無菌PBS填充，輕輕搖晃細(xì)胞板使細(xì)胞均勻分散后置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；加藥組加入不同濃度的藥物，對照組均加入等體積溶劑，其中黃芩苷對照組加入與最高濃度組等量的二甲亞砜，分別培養(yǎng)24、48、72、96 h。 用酶標(biāo)儀檢測在 450 m 處的吸光度A值，實驗重復(fù)3次。

2.4 細(xì)胞劃痕損傷實驗 首先將實驗分組：對照組（0 μmol／L 組 ）、50 μmol／L 組 、100 μmol／L 組 、200μmol／L組；用 marker筆在 6孔板背后，用直尺均勻地劃橫線，大約每隔0.5～1 cm一道，橫穿過孔，每孔至少穿過5條線。接種約5×105個／孔的上述不同分組的細(xì)胞，使細(xì)胞過夜后能鋪滿整孔。第2天用200μL格的槍頭比著直尺，盡量垂至于背后的橫線劃痕，槍頭要垂直，不能傾斜。用PBS洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞，加入含10%的胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基2 mL，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。分別于 0、24、48、72、96 h 觀察細(xì)胞遷移距離，拍照并測量其遷移距離。

2.5 Western blot法檢測Cx43蛋白表達(dá) 每單個組織樣本經(jīng)PBS洗后，加入300μL RIPA緩沖液裂解30 min，17 000 r／min離心15 min后取上清作為蛋白提取物，進(jìn)行BCA蛋白定量。取20μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE實驗。通過SDS-PAGE分離，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將含有分離出的蛋白質(zhì)的膜用含5%BSA的TBST緩沖液（25 mM Tris，190 mM NaCl，0.05%Tween 20，pH 7.5）在室溫下封閉 2 h。隨后用所述的 Cx43 一抗（1∶1 000）和 β-actin（1∶2 000），4℃孵育過夜。TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min。將膜用相應(yīng)的結(jié)合辣根過氧化物酶（HRP）的二抗（1∶5 000）在室溫下孵育 1 h。TBST 緩沖液再次洗膜3次，每次10 min。采用增強的化學(xué)發(fā)光法檢測，并由ChemiDoc MP成像系統(tǒng)進(jìn)行成像。靶蛋白的定量通過光密度分析，并用β-actin進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，采用t檢驗。

3 結(jié) 果

3.1 黃芩苷對肺癌細(xì)胞A549增殖能力的影響 見表1。

表1 黃芩苷對肺癌細(xì)胞A549增殖能力的影響（A值，±s）

表1 黃芩苷對肺癌細(xì)胞A549增殖能力的影響（A值，±s）

注：與對照組比較，1） P＜0.01，2） P＜0.05。

組別對照組50 μmol／L 組100 μmol／L 組200 μmol／L 組0 h 0.45±0.05 0.48±0.04 0.46±0.05 0.47±0.04 24 h 0.74±0.02 0.66±0.031）2）0.51±0.051）2）0.51±0.161）2）48 h 1.14±0.02 0.97±0.031）2）0.74±0.011）2）0.58±0.061）2）72 h 1.59±0.06 1.48±0.012）0.90±0.041）2）0.70±0.031）2）96 h 1.59±0.06 1.77±0.031）2）1.06±0.041）2）0.84±0.041）2）

3.2 黃芩苷對肺癌細(xì)胞A549遷移能力的影響見圖1、表2。

圖1 黃芩苷對A549細(xì)胞遷移能力的影響（×200）

表2 黃芩苷對肺癌細(xì)胞A549遷移能力的影響（n＝6，±s） μm

表2 黃芩苷對肺癌細(xì)胞A549遷移能力的影響（n＝6，±s） μm

注：與對照組比較，1） P＜0.01，2） P＜0.05。

組別對照組50 μmol／L 組100 μmol／L 組200 μmol／L 組0 h 0 0 0 0 24 h 2.88±0.24 2.33±0.232）1.59±0.181）0.86±0.121）48 h 5.24±0.16 4.26±0.111）3.37±0.081）2.18±0.171）72 h 5.31±0.29 4.69±0.142）4.28±0.151）3.06±0.441）96 h 6.00±0.22 5.40±0.172）4.71±0.171）4.19±0.181）

3.3 黃芩苷對肺癌細(xì)胞A549蛋白Cx43表達(dá)的影響 見圖 2、圖 3。

圖2 黃芩苷干預(yù)A549細(xì)胞Cx43蛋白表達(dá)電泳圖

圖3 黃芩苷對肺癌細(xì)胞A549蛋白Cx43表達(dá)的影響

4 討論

藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)：黃芩具有抗腫瘤作用，包括誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、控制細(xì)胞周期、抗氧化、抗炎、誘導(dǎo)細(xì)胞分化、降低細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力［3］。黃芩苷是黃芩主要的有效成分之一，近年來，隨著對黃芩苷抗腫瘤作用的深入研究，發(fā)現(xiàn)其還能抑制黏液表皮樣癌腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡［4］。目前研究發(fā)現(xiàn)，對黃芩苷抗腫瘤作用的實驗研究主要集中在人前列腺癌、膀胱癌、肝細(xì)胞癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、宮頸癌等惡性腫瘤［5-7］。但關(guān)于黃芩苷對肺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力的作用的報道較少。本研究通過CKK-8法和細(xì)胞劃痕實驗證實：不同濃度的黃芩苷對肺癌細(xì)胞A549增殖和遷移能力具有顯著的抑制作用，且這種抑制呈現(xiàn)劑量依賴性。

為了探討黃芩苷對肺癌細(xì)胞A549抑制作用的機(jī)制，我們進(jìn)一步檢測連接蛋白Cx43的表達(dá)水平。相關(guān)研究已證明：Cx43與腫瘤的生長呈負(fù)相關(guān)，并主要與Cx43調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，Cx43可能是腫瘤的重要抑制因素［8］。Cx43蛋白在肺癌組織中表達(dá)下降，且表達(dá)下降程度與臨床病理參數(shù)相關(guān)，Cx43可通過細(xì)胞周期調(diào)節(jié)抑制細(xì)胞生長速度［9］。Cx43蛋白在正常組織中表達(dá)陽性率均比在原發(fā)性肺癌組織中表達(dá)陽性率高，在進(jìn)展的非小細(xì)胞肺癌中陽性表達(dá)率下降，它的mRNA表達(dá)的水平與組織類型、臨床分期、腫瘤分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)［10］。

本研究顯示：肺癌細(xì)胞A549中連接蛋白Cx43的表達(dá)水平在黃芩苷作用后明顯上升，提示黃芩苷可通過上調(diào)連接蛋白Cx43表達(dá)來抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移能力。