陳 俊 ，許惠鳳 ，鄭春松 ，葉錦霞 ，陳振沅 ，邱建清 ，劉淑如 ，劉獻祥 ，吳廣文

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建 福州 350122；2.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點實驗室，福建 福州 350122）

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種多見于中老年人的退行性關(guān)節(jié)疾病，發(fā)病率隨年齡而增加［1］，易反復(fù)發(fā)作、纏綿難愈，具有較高的致殘率［2－3］，其防治已成為醫(yī)學(xué)界研究的難點問題之一。獨活寄生湯長期應(yīng)用于治療KOA，療效顯著［4-7］。前期研究表明獨活寄生湯通過抑制軟骨基質(zhì)主要成分丟失，有效減輕KOA大鼠關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)破壞［8］；通過激活G蛋白偶聯(lián)信號傳導(dǎo)通路抑制軟骨基質(zhì)降解，修復(fù)受損的軟骨組織［9］；有效抑制軟骨細胞凋亡［10］，但是否通過調(diào)節(jié)蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）／免疫球蛋白結(jié)合蛋白（immunoglobulin-binding protein，BiP）信號通路，尚不明確。本實驗進一步觀察獨活寄生湯含藥血清對大鼠退變軟骨細胞PERK／Bip信號通路關(guān)鍵調(diào)控因子PERK、Bip、真核細胞翻譯起始因子-2α（eukaryotic initiation factor 2α，eIF-2α）、轉(zhuǎn)錄激活因子-4（activating transcription factor 4，ATF-4）、生長抑制 DNA損傷基因153抗原（growth arrest and DNA damage-inducible 153，GADD153）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（cysteine containing aspartate specific protease，Caspase）-9、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（cysteine containing aspartate specific protease，Caspase）-3 蛋白的影響，探討?yīng)毣罴纳鷾种栖浌羌毎蛲龅淖饔脵C制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 36只2月齡和20只4周齡清潔級雄性SD大鼠，購于上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司［SCXK（滬）2012-0002］。

1.2 實驗藥物 獨活寄生湯的組成藥物均購于福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院藥劑科。

1.3 實驗試劑 DMEM培養(yǎng)基（美國Hyclone公司）；胎牛血清（美國GIBCO公司）；0.25%胰蛋白酶（美國Hyclone公司）；Ⅱ型膠原酶粉末（美國Sigma公司）；Bip、eIF-2α、ATF-4、GADD153 和 Caspase-3一抗（美國 abcam公司）；Caspase-9一抗（美國Thermo Fisher Scientific公司）；PERK 一抗、二抗（美國Cell Signaling Technology公司）。

1.4 實驗儀器 蛋白核酸分析儀（美國Beckman Coulter公司）；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)ChemiDocXRS+（美國Bio-Rad公司）。

2 實驗方法

2.1 含藥血清和空白血清的制備 36只2月齡SD大鼠，隨機分為含藥血清組和空白血清組2組，18只／組。根據(jù)臨床等效劑量換算［11］，含藥血清組按照 9.3 g／（kg·d）的劑量灌服獨活寄生湯，空白血清組按照10 mL／（kg·d）的劑量灌服0.9%生理鹽水，連續(xù)灌胃7 d后，麻醉后行腹主動脈采血，離心獲取上層血清，56℃水浴滅活30 min，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細胞模型的復(fù)制和藥物干預(yù) 參照課題組前期取材方法，將4周齡大鼠用75%酒精浸泡5 min，無菌條件下游離并截取膝關(guān)節(jié)，置入無菌培養(yǎng)皿，帶入超凈工作臺操作。先用PBS充分漂洗，刮除關(guān)節(jié)周圍附著的肌肉、脂肪等組織后用PBS充分漂洗。用刀片削取每個關(guān)節(jié)表面的軟骨，PBS充分漂洗軟骨小塊3次，采用酶消化法，消化、獲取正常軟骨細胞［12］，培養(yǎng)、傳代至第三代，再予 10 ng／mL IL-1β誘導(dǎo)24 h，獲得退變軟骨細胞［13-14］。含藥血清和空白血清分別干預(yù)24、48和72 h后，檢測相關(guān)指標(biāo)。

2.3 Western Blot法檢測退變軟骨細胞蛋白表達血清干預(yù)結(jié)束后，提取退變軟骨細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，Western Blot法檢測PERK、Bip、eIF-2α、ATF-4、GADD153、Caspase-9 和 Caspase-3蛋白表達情況，抗體稀釋倍數(shù)如下：PERK（1∶1 000）、Bip（1∶5 000）、eIF-2α（1∶2 500）、ATF-4（1∶1 000）、GADD153（1∶2 500）、Caspase-9（1∶300）和 Caspase-3（1∶500）。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料符合正態(tài)分布的采用（±s）進行描述。2組間比較采用重復(fù)測量方差分析；同一時間點2組間比較使用Multivariate分析。

3 結(jié)果

3.1 血清干預(yù)退變軟骨細胞蛋白電泳結(jié)果 見圖1。

圖1 血清干預(yù)退變軟骨細胞蛋白電泳圖

3.2 血清對退變軟骨細胞蛋白表達的影響 見表1～7。

表1 2組退變軟骨細胞中PERK蛋白含量比較（s）

表1 2組退變軟骨細胞中PERK蛋白含量比較（s）

注：1）主效應(yīng)的F值和P值；2）交互效應(yīng)的F值和P值。

組別空白血清組含藥血清組F值P值干預(yù)24 h 0.312±0.006 0.228±0.038 14.008 0.020干預(yù)48 h 0.227±0.037 0.160±0.018 7.808 0.049干預(yù)72 h 0.189±0.037 0.113±0.021 9.293 0.038 F值30.820 55.768 77.0041）0.3812）P值0.013 0.004 0.0001）0.6382）

表2 2組退變軟骨細胞中Bip蛋白含量比較（±s）

表2 2組退變軟骨細胞中Bip蛋白含量比較（±s）

注：1）主效應(yīng)的F值和P值；2）交互效應(yīng)的F值和P值。

組別空白血清組含藥血清組F值P值干預(yù)24 h 0.696±0.059 0.503±0.051 18.368 0.013干預(yù)48 h 0.536±0.043 0.364±0.055 18.015 0.013干預(yù)72 h 0.476±0.041 0.224±0.106 14.590 0.019 F值77.185 47.739 109.6441）3.0042）P值0.012 0.008 0.0001）0.1382）

表3 2組退變軟骨細胞中eIF-2α蛋白含量比較（±s）

表3 2組退變軟骨細胞中eIF-2α蛋白含量比較（±s）

注：1）主效應(yīng)的F值和P值；2）交互效應(yīng)的F值和P值。

組別空白血清組含藥血清組F值P值干預(yù)24 h 0.391±0.042 0.250±0.042 16.876 0.015干預(yù)48 h 0.309±0.032 0.127±0.010 89.436 0.001干預(yù)72 h 0.227±0.064 0.071±0.022 16.069 0.016 F值14.513 26.219 38.0631）0.5602）P值0.039 0.020 0.0001）0.5802）

表4 2組退變軟骨細胞中ATF-4蛋白含量比較（±s）

表4 2組退變軟骨細胞中ATF-4蛋白含量比較（±s）

注：1）主效應(yīng)的F值和P值；2）交互效應(yīng)的F值和P值。

組別空白血清組含藥血清組F值P值干預(yù)24 h 0.851±0.075 0.632±0.099 9.420 0.037干預(yù)48 h 0.696±0.085 0.494±0.064 10.724 0.031干預(yù)72 h 0.544±0.087 0.389±0.035 8.251 0.045 F值31.726 19.662 50.5691）0.7322）P值0.022 0.033 0.0011）0.4672）

表5 2組退變軟骨細胞中GADD153蛋白含量比較（s）

表5 2組退變軟骨細胞中GADD153蛋白含量比較（s）

注：1）主效應(yīng)的F值和P值；2）交互效應(yīng)的F值和P值。

組別空白血清組含藥血清組F值P值干預(yù)24 h 0.638±0.059 0.446±0.080 11.192 0.029干預(yù)48 h 0.501±0.038 0.294±0.080 16.298 0.016干預(yù)72 h 0.436±0.080 0.226±0.044 15.773 0.017 F值15.375 31.152 42.3151）0.0792）P值0.035 0.008 0.0001）0.9052）

表6 2組退變軟骨細胞中Caspase-9蛋白含量比較（±s）

表6 2組退變軟骨細胞中Caspase-9蛋白含量比較（±s）

注：1）主效應(yīng)的F值和P值；2）交互效應(yīng)的F值和P值。

組別空白血清組含藥血清組F值P值干預(yù)24 h 0.458±0.016 0.354±0.059 8.848 0.041干預(yù)48 h 0.357±0.051 0.189±0.081 9.141 0.039干預(yù)72 h 0.212±0.030 0.110±0.056 7.832 0.049 F值123.452 150.302 265.0941）6.1632）P值0.005 0.002 0.0001）0.0402）

表7 2組退變軟骨細胞中Caspase-3蛋白含量比較（±s）

表7 2組退變軟骨細胞中Caspase-3蛋白含量比較（±s）

注：1）主效應(yīng)的F值和P值；2）交互效應(yīng)的F值和P值。

組別空白血清組含藥血清組F值P值干預(yù)24 h 0.580±0.066 0.420±0.025 15.326 0.017干預(yù)48 h 0.474±0.063 0.342±0.038 9.667 0.036干預(yù)72 h 0.395±0.046 0.208±0.058 19.352 0.012 F值53.426 22.944 59.5061）1.1772）P值0.013 0.038 0.0011）0.3432）

4 討論

KOA是在多種因素共同作用下，軟骨細胞、細胞外基質(zhì)、軟骨下骨三者降解和合成正常偶聯(lián)失衡的結(jié)果［15］，是常見的骨關(guān)節(jié)疾病之一［16］。 細胞凋亡是關(guān)節(jié)軟骨細胞的中心性特征，是關(guān)節(jié)軟骨退行性改變的病理因素之一［17-18］。研究表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)與軟骨細胞凋亡密切相關(guān)［19］，PERK／Bip 信號通路則是調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)引起軟骨細胞凋亡的關(guān)鍵通路［20-21］。PERK信號分子的激活可以磷酸化eIF-2α，后者可激活A(yù)TF-4，上調(diào) GADDl53表達，GADDl53則抑制Bcl-2的表達，導(dǎo)致Bcl-2／bax比例失衡，引起Caspase-9激活，活化的Caspase-9再激活 Caspase-3，從而啟動細胞的凋亡程序［22-24］。

KOA屬中醫(yī)“痹證”“痿證”范疇，氣血營衛(wèi)虧虛是致病內(nèi)因，風(fēng)寒濕邪外襲是致病外因。獨活寄生湯中獨活祛下焦與筋骨間的風(fēng)寒濕邪，為君藥。細辛散陰經(jīng)風(fēng)寒，搜筋骨風(fēng)濕，通絡(luò)止痛；秦艽除風(fēng)濕舒筋；肉桂心溫里祛寒，通利血脈，均為臣藥。桑寄生、牛膝、杜仲補肝腎，壯筋骨，祛風(fēng)濕；當(dāng)歸、川芎、地黃、芍藥養(yǎng)血活血；人參、茯苓、甘草補氣健脾，扶助正氣，均為佐藥。甘草調(diào)和諸藥，為使藥。諸藥合用，祛邪扶正，標(biāo)本兼顧，最終達到祛風(fēng)濕、止痹痛、益肝腎、補氣血之功，能針對KOA病機，起治療作用［25-26］。

為了進一步闡明獨活寄生湯含藥血清抑制退變軟骨細胞凋亡的機制，本研究采用Western Blot法檢測PERK／Bip信號通路中關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子PERK、Bip、eIF-2α、ATF-4、GADD153、Caspase-9、Caspase-3蛋白表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著干預(yù)時間的延長，空白血清 組 和 含 藥 血 清 組 PERK、Bip、eIF-2α、ATF-4、GADD153、Caspase-9、Caspase-3 蛋白表達量均逐漸降低，以含藥血清組降低更為明顯，表明空白血清組和含藥血清組均可時間依賴性地降低PERK、Bip、eIF-2α、ATF-4、GADD153、Caspase-9、Caspase-3表達，且含藥血清組效果優(yōu)于空白血清組。

綜上可知，獨活寄生湯可能是通過調(diào)控PERK／Bip信號通路中關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子PERK、Bip、eIF-2α、ATF-4、GADD153、Caspase-9 和 Caspase-3 蛋白表達，進而抑制軟骨細胞凋亡，從而起到治療KOA的作用。