陳玎玎 黃淑芳 王才益 應(yīng)志豪 龔利洋 汪麗芬

(杭州動(dòng)物園，杭州，310008)

弓形蟲(Toxoplasmagondii)是一種可以感染包括鳥類、人類及獸類在內(nèi)的幾乎所有溫血性動(dòng)物的機(jī)會(huì)致病原蟲，呈世界性流行[1-2]。人或動(dòng)物誤食被弓形蟲卵囊、弓形蟲包囊、速殖子等污染的食物或者水，均有可能感染弓形蟲[3-4]。弓形蟲對(duì)人和動(dòng)物危害嚴(yán)重，可導(dǎo)致孕婦流產(chǎn)、死胎、先天性畸形，也會(huì)造成免疫力低下[5]。研究發(fā)現(xiàn)，重度的弓形蟲感染可導(dǎo)致澳大利亞有袋目(Marsupialia)、新世界猴(Platyrrhini)、狐猴(Lemuridae)、兔猻(Otocolobusmanul)、金絲雀(Serinuscanaria)類等野生動(dòng)物死亡[2，5-6]。野生動(dòng)物弓形蟲慢性感染時(shí)一般無明顯癥狀，這不僅給患病動(dòng)物的診斷帶來極大的困難，而且對(duì)公共安全存在潛在的威脅，因此，對(duì)野生動(dòng)物弓形蟲感染情況的調(diào)查顯得尤其重要。

國(guó)內(nèi)動(dòng)物園總量約200家，然而在野生動(dòng)物感染弓形蟲方面的調(diào)查相對(duì)較少，國(guó)內(nèi)現(xiàn)報(bào)道的僅有北京、成都、福州、上海，感染率在1.9%～47.46%[7-13]之間，成都大熊貓繁育基地、黑龍江東北虎林園、廣東等地也有零星發(fā)現(xiàn)[14-16]。另外，青海、新疆、北京等地分別對(duì)部分高原動(dòng)物、嚙齒動(dòng)物及鳥類進(jìn)行調(diào)查，感染率分別為10.61%，0.52%(1/192)及27.48%[17-19]。杭州動(dòng)物園首次對(duì)園內(nèi)野生動(dòng)物進(jìn)行弓形蟲血清學(xué)和分子生物學(xué)調(diào)查，以期為野生動(dòng)物弓形蟲病的診斷和治療提供指導(dǎo)，同時(shí)為同行業(yè)提供指導(dǎo)和借鑒。

1 材料與試劑

1.1 野生動(dòng)物血清及全血樣本

在2015～2017年期間共采集杭州動(dòng)物園35種野生動(dòng)物血清118份，其中哺乳綱食草動(dòng)物50份、食肉動(dòng)物43份、靈長(zhǎng)類動(dòng)物6份、禽類動(dòng)物19份，無菌采集血液分離出血清。采集到全血13份，其中哺乳綱食草動(dòng)物8份，食肉動(dòng)物1份，靈長(zhǎng)類3份，同樣-20℃冰箱保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑設(shè)備

1.2.1 試劑

ID Screen toxoplasmosis indirect Multi-species試劑盒購自IDvet innovative Diagnostics，TIANamp Blood DNA Kit 血液基因組DNA提取試劑盒購自天根生物有限公司。

1.2.2 設(shè)備

酶標(biāo)儀購自Molecular Devices公司、Eppendorf排槍、Eppendorf移液槍、恒溫箱等。

2 弓形蟲抗體檢測(cè)方法

2.1 采用間接酶聯(lián)免疫試驗(yàn)(ELISA)法原理

微量板已經(jīng)用弓形體P30抗原包被，加入樣本和對(duì)照后，經(jīng)過孵育，若樣本中含有抗體，就會(huì)形成“抗原-抗體”復(fù)合物。通過第1次洗板后，再加入過氧化物酶結(jié)合物，含抗體樣本孔內(nèi)將形成“抗原-抗體-酶”的復(fù)合物。經(jīng)過第2次洗板，加入含底物TMB液。若存在抗體，溶液將呈現(xiàn)藍(lán)色，并在加入終止液后轉(zhuǎn)為黃色；若無抗體存在將不呈現(xiàn)任何顯色反應(yīng)，呈色反應(yīng)與樣本中抗體含量成正比。在450 nm波長(zhǎng)檢測(cè)OD值，計(jì)算每個(gè)樣本S/P的百分比，即S/P%=(OD樣本-OD陰性對(duì)照)/(OD陽性對(duì)照-OD陰性對(duì)照)。當(dāng)S/P%≤40%時(shí)為陰性，當(dāng)40%

2.2 檢測(cè)步驟

樣本準(zhǔn)備：保證不同樣品孵育時(shí)間一致，用一個(gè)空白96孔板對(duì)樣本和對(duì)照樣本用樣品稀釋液2進(jìn)行1∶10的稀釋。

洗滌液準(zhǔn)備：用蒸餾水按照1∶20的比例稀釋濃縮洗液，每個(gè)樣本進(jìn)行2次洗板需要洗滌液600 μL，根據(jù)樣本的數(shù)量計(jì)算配制的量。

酶結(jié)合物準(zhǔn)備：用樣品稀釋液3按1∶10的比例稀釋。

檢測(cè)：根據(jù)樣本量取出包被好的微量孔的個(gè)數(shù)，對(duì)照孔均設(shè)2個(gè)，每孔加稀釋過的樣本液體100 μL，在21 ℃(±5℃)下孵育(45±4)min后，進(jìn)行洗板，要洗3次，最后一次在甩掉洗滌液后要吸去剩下的液體。以較快的速度加入稀釋好的酶結(jié)合物液體100 μL，最好采用連續(xù)加液器或排槍，在21 ℃(±5℃)下再孵育(30±3)min后，進(jìn)行第2次洗板，同上洗3次。最后每孔加入100 μL底物，孵育(15±2)min后每孔加入100 μL終止液，然后在酶標(biāo)儀的450 nm波長(zhǎng)讀取OD值。

3 弓形蟲分子生物學(xué)鑒定方法

3.1 DNA的提取

使用TIANamp Blood DNA Kit 血液基因組DNA提取試劑盒對(duì)全血樣本進(jìn)行DNA提取。

3.2 PCR擴(kuò)增

參照袁恒青等[20]的方法，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后觀察。

4 結(jié)果及分析

4.1 弓形蟲抗體檢測(cè)結(jié)果

118份血清弓形蟲抗體IgG檢測(cè)結(jié)果為，總體陽性率21.19%(25/118)，其中食草性動(dòng)物陽性率32.0%(16/50)，食肉性動(dòng)物陽性率18.60%(8/43)，靈長(zhǎng)類動(dòng)物陽性率16.67%(1/6)，禽類動(dòng)物未檢測(cè)到陽性抗體(0/19)。通過SPSS軟件采用卡方檢驗(yàn)分析4類動(dòng)物樣本數(shù)與陽性樣本數(shù)差異性，食草性動(dòng)物與禽類動(dòng)物弓形蟲抗體IgG差異極顯著(x2=7.650，P<0.01)，食肉性動(dòng)物與禽類動(dòng)物形蟲抗體IgG差異顯著(x2=3.089，P<0.05)。具體情況見表1。

表1 35種野生動(dòng)物弓形蟲血清學(xué)抗體IgG檢測(cè)結(jié)果

續(xù)表1

注：表格中“/”表示S/P<50%(陰性)

Note：The“/”meansS/P<50% in the table

4.2 弓形蟲抗原分子生物學(xué)檢測(cè)結(jié)果

對(duì)從全血樣本中提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，19號(hào)樣本(金錢豹)電泳成像結(jié)果為弱陽性，其余樣本均為陰性(圖1)。

圖1 PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果Fig.1 Result of PCR amplication 注：M為2000 Marker(2000 bp，1000 bp，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp)，泳道1為陽性對(duì)照，2為陰性對(duì)照，7～11，13～14，17～22為待測(cè)樣本，分別為黑猩猩、黇鹿、斑馬、梅花鹿、黇鹿、梅花鹿、黇鹿、黑猩猩、斑馬、金錢豹、黑猩猩、黇鹿、黇鹿，其余編號(hào)樣本與本次調(diào)查無關(guān) Note：M：2000 Marker(2000 bp，1000 bp，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp)；1：Positive control；2：Negative control；7-11，13-14，17-11：chimpanzee，fallow deer，zebra，sika deer，fallow deer，sika deer，fallow deer，chimpanzee，zebra，leopard，chimpanzee，fallow deer，fallow deer，respectively.Other samples have nothing to do with this survey

5 討論

弓形蟲IgG抗體一般在感染后1～2周出現(xiàn)陽性，3～5周抗體效價(jià)達(dá)到高峰，并可維持多年。目前，弓形蟲血清型檢測(cè)的方法主要有改進(jìn)凝集檢測(cè)法(MAT)、間接紅細(xì)胞凝集檢測(cè)法(IHAT)和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)法(ELISA)等[21]。張述義等[12]用ELISA、MAT和IHAT 3種方法檢測(cè)動(dòng)物與人血清的弓形蟲抗體，結(jié)果顯示：這3種檢測(cè)方法對(duì)其弓形蟲陽性檢出率無顯著差異，都可用于弓形蟲血清流行病學(xué)調(diào)查。本試驗(yàn)采用ELISA法檢測(cè)野生動(dòng)物血清抗體。

杭州動(dòng)物園118份野生動(dòng)物檢測(cè)結(jié)果總體陽性率為21.19%，與國(guó)內(nèi)成都、上海和福州動(dòng)物園等[7-8，10-11]和國(guó)外部分動(dòng)物園[3，6，22-23]弓形蟲檢測(cè)相比，感染率略低。其中，食草動(dòng)物感染率顯著高于其他幾類動(dòng)物，羊駝?dòng)壬酰@可能與場(chǎng)館設(shè)計(jì)以及園內(nèi)存在的流浪貓有關(guān)。以羊駝為例，羊駝的外場(chǎng)為開放式的生態(tài)化展示結(jié)構(gòu)，沒有籠網(wǎng)等物理隔離提高了動(dòng)物的展示效果，但也導(dǎo)致了流浪貓可以自由進(jìn)出籠舍。杭州動(dòng)物園曾對(duì)區(qū)域內(nèi)流浪貓的血清樣本進(jìn)行過檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其弓形蟲抗體IgG陽性率約為50%，陽性率高。貓科(Felidae)動(dòng)物為弓形蟲重要的終宿主，弓形蟲卵囊會(huì)隨貓科動(dòng)物的糞便在環(huán)境中傳播[2]。流浪貓弓形蟲的感染率處于較高水平，在弓形蟲的傳播過程中發(fā)揮著重要作用[13，24]，羊駝很有可能因采食到被弓形蟲卵囊污染的食物而感染。以上情況都提示我們應(yīng)嚴(yán)格控制流浪貓數(shù)量，并加強(qiáng)對(duì)動(dòng)物籠舍的消毒管理，切斷傳播途徑。

對(duì)于禽類弓形蟲的檢測(cè)，多篇文獻(xiàn)檢測(cè)結(jié)果間存在差異。Tidy等[3]對(duì)葡萄牙的兩所動(dòng)物園的檢測(cè)顯示22.1%禽類弓形蟲檢測(cè)為陽性，Lopes等[4]對(duì)葡萄牙部分區(qū)域的野生動(dòng)物進(jìn)行弓形蟲檢測(cè)顯示50%的禽類弓形蟲檢測(cè)為陽性；Minervino等[6]對(duì)巴西部分區(qū)域的野生動(dòng)物弓形蟲的檢測(cè)結(jié)果顯示未發(fā)現(xiàn)陽性結(jié)果；胡春梅等[19]對(duì)北京地區(qū)131只野生鳥類的弓形蟲血清學(xué)檢測(cè)陽性率為27.48%。周忠勇等[25]曾對(duì)上海動(dòng)物園內(nèi)20種36份鳥類血清進(jìn)行檢測(cè)，陽性率11.11%。Huang等[26]使用PCR對(duì)國(guó)內(nèi)不同地區(qū)178只野生鳥類肌肉樣本檢測(cè)，陽性率2.24%(4/178)。對(duì)于本實(shí)驗(yàn)中樣本未檢測(cè)出抗體陽性結(jié)果，可能與本次采集禽類樣本量有限(僅以藍(lán)孔雀、蓑羽鶴及小天鵝為主)有關(guān)，也有杭州動(dòng)物園禽類弓形蟲感染率較低的可能，其深層次原因有待進(jìn)一步調(diào)查。

PCR檢測(cè)僅有1個(gè)陽性的結(jié)果，該個(gè)體抗體檢測(cè)也為陽性，確認(rèn)其處于感染期。其余抗體檢測(cè)陽性，分子生物學(xué)檢測(cè)陰性顯示動(dòng)物可能曾經(jīng)受到過感染。對(duì)于本次檢測(cè)中確診處于弓形蟲病感染期的金錢豹個(gè)體，雖然其并未進(jìn)入繁殖梯隊(duì)，但作為弓形蟲感染的終末宿主，為保障動(dòng)物福利、目前已針對(duì)性用藥。另外，因弓形蟲病經(jīng)治療后個(gè)體極易成為帶蟲者，在日常飼養(yǎng)管理中，要嚴(yán)格注意清潔消毒，預(yù)防交叉感染和重復(fù)感染。有報(bào)道未經(jīng)加工的生肉是造成弓形蟲在人群中傳播的主要原因[27]，再次提示我們要做好消毒工作。