陳玎玎 黃淑芳 王才益 應志豪 龔利洋 汪麗芬

(杭州動物園，杭州，310008)

弓形蟲(Toxoplasmagondii)是一種可以感染包括鳥類、人類及獸類在內的幾乎所有溫血性動物的機會致病原蟲，呈世界性流行[1-2]。人或動物誤食被弓形蟲卵囊、弓形蟲包囊、速殖子等污染的食物或者水，均有可能感染弓形蟲[3-4]。弓形蟲對人和動物危害嚴重，可導致孕婦流產、死胎、先天性畸形，也會造成免疫力低下[5]。研究發(fā)現(xiàn)，重度的弓形蟲感染可導致澳大利亞有袋目(Marsupialia)、新世界猴(Platyrrhini)、狐猴(Lemuridae)、兔猻(Otocolobusmanul)、金絲雀(Serinuscanaria)類等野生動物死亡[2，5-6]。野生動物弓形蟲慢性感染時一般無明顯癥狀，這不僅給患病動物的診斷帶來極大的困難，而且對公共安全存在潛在的威脅，因此，對野生動物弓形蟲感染情況的調查顯得尤其重要。

國內動物園總量約200家，然而在野生動物感染弓形蟲方面的調查相對較少，國內現(xiàn)報道的僅有北京、成都、福州、上海，感染率在1.9%～47.46%[7-13]之間，成都大熊貓繁育基地、黑龍江東北虎林園、廣東等地也有零星發(fā)現(xiàn)[14-16]。另外，青海、新疆、北京等地分別對部分高原動物、嚙齒動物及鳥類進行調查，感染率分別為10.61%，0.52%(1/192)及27.48%[17-19]。杭州動物園首次對園內野生動物進行弓形蟲血清學和分子生物學調查，以期為野生動物弓形蟲病的診斷和治療提供指導，同時為同行業(yè)提供指導和借鑒。

1 材料與試劑

1.1 野生動物血清及全血樣本

在2015～2017年期間共采集杭州動物園35種野生動物血清118份，其中哺乳綱食草動物50份、食肉動物43份、靈長類動物6份、禽類動物19份，無菌采集血液分離出血清。采集到全血13份，其中哺乳綱食草動物8份，食肉動物1份，靈長類3份，同樣-20℃冰箱保存。

1.2 實驗試劑設備

1.2.1 試劑

ID Screen toxoplasmosis indirect Multi-species試劑盒購自IDvet innovative Diagnostics，TIANamp Blood DNA Kit 血液基因組DNA提取試劑盒購自天根生物有限公司。

1.2.2 設備

酶標儀購自Molecular Devices公司、Eppendorf排槍、Eppendorf移液槍、恒溫箱等。

2 弓形蟲抗體檢測方法

2.1 采用間接酶聯(lián)免疫試驗(ELISA)法原理

微量板已經用弓形體P30抗原包被，加入樣本和對照后，經過孵育，若樣本中含有抗體，就會形成“抗原-抗體”復合物。通過第1次洗板后，再加入過氧化物酶結合物，含抗體樣本孔內將形成“抗原-抗體-酶”的復合物。經過第2次洗板，加入含底物TMB液。若存在抗體，溶液將呈現(xiàn)藍色，并在加入終止液后轉為黃色；若無抗體存在將不呈現(xiàn)任何顯色反應，呈色反應與樣本中抗體含量成正比。在450 nm波長檢測OD值，計算每個樣本S/P的百分比，即S/P%=(OD樣本-OD陰性對照)/(OD陽性對照-OD陰性對照)。當S/P%≤40%時為陰性，當40%

2.2 檢測步驟

樣本準備：保證不同樣品孵育時間一致，用一個空白96孔板對樣本和對照樣本用樣品稀釋液2進行1∶10的稀釋。

洗滌液準備：用蒸餾水按照1∶20的比例稀釋濃縮洗液，每個樣本進行2次洗板需要洗滌液600 μL，根據(jù)樣本的數(shù)量計算配制的量。

酶結合物準備：用樣品稀釋液3按1∶10的比例稀釋。

檢測：根據(jù)樣本量取出包被好的微量孔的個數(shù)，對照孔均設2個，每孔加稀釋過的樣本液體100 μL，在21 ℃(±5℃)下孵育(45±4)min后，進行洗板，要洗3次，最后一次在甩掉洗滌液后要吸去剩下的液體。以較快的速度加入稀釋好的酶結合物液體100 μL，最好采用連續(xù)加液器或排槍，在21 ℃(±5℃)下再孵育(30±3)min后，進行第2次洗板，同上洗3次。最后每孔加入100 μL底物，孵育(15±2)min后每孔加入100 μL終止液，然后在酶標儀的450 nm波長讀取OD值。

3 弓形蟲分子生物學鑒定方法

3.1 DNA的提取

使用TIANamp Blood DNA Kit 血液基因組DNA提取試劑盒對全血樣本進行DNA提取。

3.2 PCR擴增

參照袁恒青等[20]的方法，進行PCR擴增。反應產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后觀察。

4 結果及分析

4.1 弓形蟲抗體檢測結果

118份血清弓形蟲抗體IgG檢測結果為，總體陽性率21.19%(25/118)，其中食草性動物陽性率32.0%(16/50)，食肉性動物陽性率18.60%(8/43)，靈長類動物陽性率16.67%(1/6)，禽類動物未檢測到陽性抗體(0/19)。通過SPSS軟件采用卡方檢驗分析4類動物樣本數(shù)與陽性樣本數(shù)差異性，食草性動物與禽類動物弓形蟲抗體IgG差異極顯著(x2=7.650，P<0.01)，食肉性動物與禽類動物形蟲抗體IgG差異顯著(x2=3.089，P<0.05)。具體情況見表1。

表1 35種野生動物弓形蟲血清學抗體IgG檢測結果

續(xù)表1

注：表格中“/”表示S/P<50%(陰性)

Note：The“/”meansS/P<50% in the table

4.2 弓形蟲抗原分子生物學檢測結果

對從全血樣本中提取的DNA進行PCR擴增，19號樣本(金錢豹)電泳成像結果為弱陽性，其余樣本均為陰性(圖1)。

圖1 PCR擴增電泳結果Fig.1 Result of PCR amplication 注：M為2000 Marker(2000 bp，1000 bp，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp)，泳道1為陽性對照，2為陰性對照，7～11，13～14，17～22為待測樣本，分別為黑猩猩、黇鹿、斑馬、梅花鹿、黇鹿、梅花鹿、黇鹿、黑猩猩、斑馬、金錢豹、黑猩猩、黇鹿、黇鹿，其余編號樣本與本次調查無關 Note：M：2000 Marker(2000 bp，1000 bp，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp)；1：Positive control；2：Negative control；7-11，13-14，17-11：chimpanzee，fallow deer，zebra，sika deer，fallow deer，sika deer，fallow deer，chimpanzee，zebra，leopard，chimpanzee，fallow deer，fallow deer，respectively.Other samples have nothing to do with this survey

5 討論

弓形蟲IgG抗體一般在感染后1～2周出現(xiàn)陽性，3～5周抗體效價達到高峰，并可維持多年。目前，弓形蟲血清型檢測的方法主要有改進凝集檢測法(MAT)、間接紅細胞凝集檢測法(IHAT)和酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測法(ELISA)等[21]。張述義等[12]用ELISA、MAT和IHAT 3種方法檢測動物與人血清的弓形蟲抗體，結果顯示：這3種檢測方法對其弓形蟲陽性檢出率無顯著差異，都可用于弓形蟲血清流行病學調查。本試驗采用ELISA法檢測野生動物血清抗體。

杭州動物園118份野生動物檢測結果總體陽性率為21.19%，與國內成都、上海和福州動物園等[7-8，10-11]和國外部分動物園[3，6，22-23]弓形蟲檢測相比，感染率略低。其中，食草動物感染率顯著高于其他幾類動物，羊駝尤甚，這可能與場館設計以及園內存在的流浪貓有關。以羊駝為例，羊駝的外場為開放式的生態(tài)化展示結構，沒有籠網(wǎng)等物理隔離提高了動物的展示效果，但也導致了流浪貓可以自由進出籠舍。杭州動物園曾對區(qū)域內流浪貓的血清樣本進行過檢測，發(fā)現(xiàn)其弓形蟲抗體IgG陽性率約為50%，陽性率高。貓科(Felidae)動物為弓形蟲重要的終宿主，弓形蟲卵囊會隨貓科動物的糞便在環(huán)境中傳播[2]。流浪貓弓形蟲的感染率處于較高水平，在弓形蟲的傳播過程中發(fā)揮著重要作用[13，24]，羊駝很有可能因采食到被弓形蟲卵囊污染的食物而感染。以上情況都提示我們應嚴格控制流浪貓數(shù)量，并加強對動物籠舍的消毒管理，切斷傳播途徑。

對于禽類弓形蟲的檢測，多篇文獻檢測結果間存在差異。Tidy等[3]對葡萄牙的兩所動物園的檢測顯示22.1%禽類弓形蟲檢測為陽性，Lopes等[4]對葡萄牙部分區(qū)域的野生動物進行弓形蟲檢測顯示50%的禽類弓形蟲檢測為陽性；Minervino等[6]對巴西部分區(qū)域的野生動物弓形蟲的檢測結果顯示未發(fā)現(xiàn)陽性結果；胡春梅等[19]對北京地區(qū)131只野生鳥類的弓形蟲血清學檢測陽性率為27.48%。周忠勇等[25]曾對上海動物園內20種36份鳥類血清進行檢測，陽性率11.11%。Huang等[26]使用PCR對國內不同地區(qū)178只野生鳥類肌肉樣本檢測，陽性率2.24%(4/178)。對于本實驗中樣本未檢測出抗體陽性結果，可能與本次采集禽類樣本量有限(僅以藍孔雀、蓑羽鶴及小天鵝為主)有關，也有杭州動物園禽類弓形蟲感染率較低的可能，其深層次原因有待進一步調查。

PCR檢測僅有1個陽性的結果，該個體抗體檢測也為陽性，確認其處于感染期。其余抗體檢測陽性，分子生物學檢測陰性顯示動物可能曾經受到過感染。對于本次檢測中確診處于弓形蟲病感染期的金錢豹個體，雖然其并未進入繁殖梯隊，但作為弓形蟲感染的終末宿主，為保障動物福利、目前已針對性用藥。另外，因弓形蟲病經治療后個體極易成為帶蟲者，在日常飼養(yǎng)管理中，要嚴格注意清潔消毒，預防交叉感染和重復感染。有報道未經加工的生肉是造成弓形蟲在人群中傳播的主要原因[27]，再次提示我們要做好消毒工作。