王紹紅 柴 榮 李政志 張艷芳 劉偉石 薛 原 孫 穎

(東北林業(yè)大學(xué)野生動物資源學(xué)院，哈爾濱，150040)

大腸桿菌(Escherichiacoli)作為一種機(jī)會致病菌，含有多種毒力因子，這些毒力因子對分析大腸桿菌的致病性，研究其是否存在潛在的致病能力等方面起著至關(guān)重要的作用，因此檢測相關(guān)毒力基因具有重要意義。毒力基因廣泛存在于染色體，毒力島和質(zhì)粒上[1]，是否存在水平轉(zhuǎn)移現(xiàn)象現(xiàn)在還未可知，另毒力基因存在變異現(xiàn)象，因此研究毒力基因的發(fā)展，分析其致病性，進(jìn)行毒力基因檢測，研究其內(nèi)在聯(lián)系，對于疾病的預(yù)防以及臨床指導(dǎo)用藥具有十分重要的意義。

耶爾森菌強(qiáng)毒力島(high island，HPI)常出現(xiàn)在大腸桿菌強(qiáng)毒力菌株中，是主要由irp1、irp2、irp3、irp4、irp5、fyuA、ybtA等基因組成的毒力基因簇。HPI含有編碼攝取合成Ybt相關(guān)基因，與鐵攝取與調(diào)節(jié)有關(guān)，而鐵元素是保證細(xì)菌在宿主體內(nèi)存活的關(guān)鍵因素，因此攜帶有HPI毒力島的菌株可攝取鐵元素，易在宿主體內(nèi)存活，致病，具有較強(qiáng)的毒力，而且已有研究表明HPI毒力島可在兩種細(xì)菌間水平轉(zhuǎn)移，因此，HPI毒力島的研究對大腸桿菌致病性的研究具有重要意義。另，大腸桿菌的致病性也與黏附素、毒素、侵襲性酶以及多種因子有關(guān)[2]。

本研究采用PCR法對135株東北地區(qū)狐源大腸桿菌進(jìn)行irp2，fyuA，ybtA，iucD，iss，fimH種毒力基因的檢測并進(jìn)行克隆測序，研究種毒力基因出現(xiàn)的頻率，為后續(xù)毒力因子流行情況的研究提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株

本實(shí)驗(yàn)檢測東北地區(qū)狐源大腸桿菌共135株，分離的菌株及經(jīng)過生理生化鑒定為大腸桿菌。

1.2 主要試劑

膠回收試劑盒，質(zhì)粒抽提試劑盒均購于愛思進(jìn)公司；瓊脂糖，LB，50×TAE緩沖液，DL2000 DNA maker，TaqDNA聚合酶，DH5α和pMD-18T等均購自寶生物生物技術(shù)有限公司。

1.3 引物合成

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)記載的大腸桿菌HPI毒力島主要結(jié)構(gòu)基因及其相關(guān)基因合成對引物，分別用于irp2，fyuA及fimH，iucD，iss，ybtA種毒力基因的擴(kuò)增，引物由博仕生物有限公司合成。引物序列見表1。

1.4 PCR法擴(kuò)增

irp2，fyuA及fimH，iucD，iss，ybtA基因。

表1 大腸桿菌毒力基因的引物

Tab.1 Primers for E.coli virulence genes

1.5 PCR產(chǎn)物電泳鑒定

取PCR產(chǎn)物5 μL，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，以DNA Maker DL2000為參照，EB染色后置于紫外燈下觀察。

2 結(jié)果

2.1 單個毒力基因的檢測結(jié)果

對135株大腸桿菌進(jìn)行PCR檢測：共57株檢出irp2，陽性率為42.22%；11株檢出ybtA，陽性率為 8.15%；13株檢出fyuA，陽性率為9.63%；56株檢出fimH，陽性率為41.48%；17株檢出iucD，陽性率為12.59%；1株檢出iss，陽性率為0.07%(圖1～6)。

圖1 irp2基因片斷的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 PCR amplification product of the irp2 gene fragmentM：DNA Makers DL2000Lane1-5：The positive strains for target genes

圖2 fyuA基因片斷的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.2 PCR amplification product of the fyuA gene fragmentM：DNA Makers DL2000Lane1-5：The positive strains for target genes

圖3 fimH基因片斷的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.3 PCR amplification product of the fimH gene fragmentM：DNA Makers DL2000Lane1-5：The positive strains for target genes

圖4 iss基因片斷的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.4 PCR amplification product of the iss gene fragmentM：DNA Makers DL2000Lane1：The positive strains for target genes

圖5 iucD基因片斷的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.5 PCR amplification product of the iucD gene fragmentM：DNA Makers DL2000Lane1-5：The positive strains for target genes

圖6 ybtA基因片斷的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.6 PCR amplification product of the ybtA gene fragmentM：DNA Makers DL2000Lane1-5：The positive strains for target genes

2.2 2-3個毒力基因的檢出結(jié)果

由表2可知，Irp2，fyuA以及fimH，ybtA和Irp2，fyuA，fimH分別同為陽性的菌株均有3株，分別占2.22%；Irp2，fimH同為陽性的菌株有8株，占5.93%；fimH，fyuA同為陽性的菌株有2株，占1.48%；Irp2，iucD同為陽性的菌株有9株，占6.66%；fimH，iucD同為陽性的菌株有4株，占2.96%；Irp2，ybtA同為陽性的菌株有6株，占4.44%；fyuA，iucD以及Irp2，iucD，fimH分別同為陽性的菌株均有1株，分別占0.74%，未發(fā)現(xiàn)有同時攜帶3個以上毒力基因的菌株。

表2 毒力基因檢測結(jié)果統(tǒng)計(jì)

Tab.8 Virulence gene test results statistic

3 討論

大腸桿菌致病性主要與其菌毛、毒素、抗血清活性因子、侵襲性酶及鐵獲取系統(tǒng)和生物膜形成的相關(guān)蛋白有關(guān)，它們提供了定植的能力，以及形成生物膜，捕獲鐵等基本營養(yǎng)物質(zhì)，造成上皮損傷，逃避宿主的防御機(jī)制，從而增強(qiáng)了大腸桿菌引起全身感染的能力。其中大腸桿菌產(chǎn)生的特定的毒力因子是決定其致病性的關(guān)鍵因素。

實(shí)驗(yàn)檢測了6種毒力基因，編碼不同的毒力因子，分別在大腸桿菌侵入，定植，保護(hù)細(xì)菌免受宿主細(xì)胞自噬機(jī)制的識別和捕獲，以及營養(yǎng)、分泌毒素的過程中起著重要的作用。

其中，fimH(黏附素)能夠暴露于細(xì)菌表面而不是菌毛的組成部分，是菌毛的次要成分，對D-甘露糖受體結(jié)合起著獨(dú)特的作用[7]?？少x予1型菌毛結(jié)合D-甘露糖，并因此結(jié)合許多類型的真核細(xì)胞(包括腸、肺、膀胱、腎上皮和各種炎癥細(xì)胞)的能力對保護(hù)大腸桿菌免受吞噬有直接或間接的作用[8]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示作為HPI毒力島主要結(jié)構(gòu)基因的irp2和黏附相關(guān)基因fimH的檢出率最高，同樣，在趙李祥的研究中fimH檢出率也非常高，達(dá)到90%以上[9]。在鐘杏好等的研究中，fimH檢出率也高達(dá)87.1%～91.3%[10]，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，而fimH檢出率普遍很高，這是否說明這個基因比較穩(wěn)定，以及其在大腸桿菌的生存與定植過程中是否發(fā)揮著不可或缺的作用，是否所有有定植能力的大腸桿菌都有這種毒力基因，種種問題還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

iss(保護(hù)素)是pTJ100相關(guān)基因，是在大多數(shù)APEC菌株中發(fā)生的一組質(zhì)粒相關(guān)基因[11]，賦予細(xì)菌攝取鐵和抗血清的作用，編碼與組織侵襲相關(guān)的毒力因子，與鐵的攝取與調(diào)節(jié)有直接或間接的關(guān)系[12]，在禽類菌株中更常見，而iucD在人類菌株中更為普遍[12]，在本次實(shí)驗(yàn)中iss的檢出率僅為0.07%，iucD檢出率卻為12.59%，另外，兩種基因檢出率都不高與Ewers等的82.7%、78.0%有較大出入[13]，iss檢出率也不高于Ragione等研究中的88.7%[8]，而相較于呂殿紅等人研究的28.7%也有一定的差距[14]，Bonnet等認(rèn)為iss為禽致病性大腸桿菌的標(biāo)志基因之一[2]，而在本實(shí)驗(yàn)中iss毒力基因的檢出率要明顯低于其他基因且唯一檢出的1株恰好沒有其他5種毒力基因。

另外，在此次研究中，有7個分離株同時攜帶3種毒力基因，占全部菌株的5.19%，47個菌株同時攜帶2種毒力基因，占全部菌株的34.81%，并未發(fā)現(xiàn)有攜帶更多毒力基因的菌株，根據(jù)Wang等的研究，大腸桿菌菌株的致病性與毒力相關(guān)基因的數(shù)量和組合模式密切相關(guān)[15]，因此，這里還可以做進(jìn)一步的研究。

此外，在耶爾森氏菌的鐵代謝的高致病性島(HPI)中，小鼠模型顯示HPI增加了腸外感染中的大腸桿菌毒力[16]。fyuA，irp2，ybtA屬于HPI毒力島的核心和功能基因，是它的的3個啟動區(qū)。其中ybtA屬Arac轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)家族，促進(jìn)fyuA、irp2、irp6等啟動子的表達(dá)抑制自身啟動子[4]，對Ybt的合成攝取起調(diào)節(jié)作用[16]。irp2與攝鐵能力有關(guān)，參與鐵載體的合成和表達(dá)，可作為HPI的標(biāo)志基因；fyuA可編碼鐵抑制外膜蛋白，是Ybt細(xì)菌素及巴氏桿菌素的外膜受體，與大腸桿菌毒力密切相關(guān)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，同為HPI毒力島主要結(jié)構(gòu)基因，同時攜帶irp2與fyuA基因的菌株卻少于同時攜帶有irp2與fimH的菌株且fyuA的檢出率低于irp2。事實(shí)上，HPI毒力島不完整的現(xiàn)象在胡靜等人的研究中曾有記載，fyuA在HPI核心區(qū)的邊緣，在進(jìn)化和轉(zhuǎn)移過程中容易破壞和丟失，所以fyuA的檢出率往往低于irp2[17]，且在HPI核心區(qū)中除邊緣丟失的情況外，還存在其他形式的缺失。且在胡靜的實(shí)驗(yàn)中，EAggEC菌株所攜帶的與耶爾森菌同源的HPI毒力島，即便HPI存在，正常情況下并不表現(xiàn)強(qiáng)毒力和生長抑制，也并不意味著細(xì)菌獲得了致病性，猜想與菌種的遺傳差異有關(guān)，那么是否HPI在水平轉(zhuǎn)移過程中也存在這種情況，那么HPI僅存在于強(qiáng)毒力菌株是否還成立呢?另外，irp2與fimH，irp2與iucD同時存在的菌株數(shù)頗多是否是偶然，是否說明irp2與fimH，iucD之間存在某種關(guān)聯(lián)還有待深入研究。

研究表明，大量的菌株可形成一個重要的毒力基因庫，在某些情況下，并與其他因素結(jié)合，可能會產(chǎn)生新的致病菌株。新的致病形式的大腸桿菌往往通過不同毒力基因的組合而出現(xiàn)，而大腸桿菌也能夠?qū)⒍玖蜉敵龅狡渌锾m氏陰性生物。因此，檢測環(huán)境中的大腸桿菌毒力基因是至關(guān)重要的。