顧有花，熊峰，閆學平，周健，王月菊

(1 蘇州大學附屬第一醫(yī)院，江蘇蘇州215006;2北京市第一中西醫(yī)結合醫(yī)院)

胃癌起源于胃黏膜上皮，是常見的消化道惡性腫瘤，世界范圍內，其發(fā)病率位居第四，病死率僅低于肺癌，是癌癥死因的第二位[1]。目前外科根治性切除術，結合或不結合其他抗腫瘤手段的綜合治療仍是胃癌的最佳治療手段[2]。但多數(shù)胃癌患者確診時已至中晚期，基礎身體條件較差，較難開展手術。胃癌起病初期無明顯癥狀，僅有患者主訴出現(xiàn)噯氣、上腹飽脹或隱痛等非特異性癥狀，與胃炎、胃潰瘍等胃慢性疾病鑒別診斷困難[3]。長鏈非編碼RNA(LncRNA)是表觀遺傳學的研究熱點之一，近期多項研究表明LncRNA與阿爾茲海默癥[4]、強直性肌營養(yǎng)不良[5]及多種惡性腫瘤[6]等復雜疾病密切相關。2012年6月～2016年12月，我們觀察了胃癌組織中LncRNA煙酰胺核苷酸反義轉氫酶RNA1(NNT-AS1)的表達，并探討其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取本院2012年6月～2016年12月收治的胃癌患者的胃癌組織及癌旁非腫瘤組織凍存標本77例份，標本由根治性胃癌切除術中切取，胃癌組織標本取自腫瘤組織中央非壞死區(qū)域，癌旁非腫瘤組織標本取自距離腫瘤組織5 cm以上非腫瘤組織。病例均經(jīng)病理科確診為原發(fā)性胃癌。其中男51例、女26例，年齡為50～80歲，≤60歲23例、>60歲54例。TNM分期Ⅰ期9例，Ⅱ期30例，Ⅲ期35例，Ⅳ期3例；經(jīng)病理科確診胃腺癌75例，胃印戒細胞癌2例；組織分化程度為高分化9例，中分化39例，低分化29例；脈管侵襲36例；淋巴結轉移37例；神經(jīng)轉移16例。納入標準：①經(jīng)病理科確診為原發(fā)性胃癌；②患者病歷資料、隨訪資料完整；③患者胃癌組織、癌旁組織凍存標本保存完好；④術前未經(jīng)放、化療等其他抗腫瘤手段治療；⑤未合并其他惡性腫瘤；⑥未合并其他影響RT-PCR結果的嚴重疾病。本研究經(jīng)醫(yī)學倫理委員會批準，患者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 LncRNA NNT-AS1表達檢測 采用RT-PCR法。向稱取的等量凍存樣本中加入TRIzol試劑(美國Invitrogen 公司)提取總RNA。以紫外分光光度計檢測總RNA純度，符合本研究要求的總RNA樣本OD260/OD280位于1.8～2.0。應用High-capacity cDNA Reverse Transcription kit(美國Thermo Fisher公司)將總RNA逆轉錄為cDNA。本研究RT-PCR過程嚴格遵循Roche Light Cycler?480 Ⅱ熒光定量PCR儀(本實驗室自有)產(chǎn)品說明書，使用TaqMan?Universal Master Mix Ⅱ without UNG預混液(美國Invitrogen公司)，以β-actin為內參，反應引物序列：LncRNA NNT-AS1正向引物：5′-TGAAGTTTTCAGGGACACAT-3′，反向引物：5′-TTTAGACCTGTTTCTTTGTT-3′；β-actin正向引物：5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，反向引物：5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′。以2-ΔΔCt法計算LncRNA NNT-AS1的相對表達量。

1.3 隨訪 以患者術后出院為觀察起點，應用電話、電子通訊等手段，對患者及家屬進行隨訪。隨訪截止于2017年12月，隨訪10～65(36.48±15.15)個月，中位隨訪時長為36個月。

2 結果

2.1 不同胃部組織中LncRNA NNT-AS1表達比較 胃癌及癌旁正常組織中LncRNA NNT-AS1相對表達量分別為0.509±0.110、0.103±0.004，二者比較差異有統(tǒng)計學意義(t=32.366，P=0.000)。

2.2 胃癌組織中LncRNA NNT-AS1表達與患者臨床病理特征的關系 LncRNA NNT-AS1在胃癌組織中的表達與患者腫瘤分化程度、TNM分期、脈管侵襲、淋巴結轉移相關(P均<0.05)，而與患者年齡、性別、神經(jīng)侵襲無關(P均>0.05)。見表1。

表1 胃癌組織中LncRNA NNT-AS1表達與患者臨床病理特征的關系±s)

2.3 胃癌組織中LncRNA NNT-AS1表達與患者預后的關系 將納入本研究的患者依照胃癌組織中LncRNA NNT-AS1在胃癌組織中的表達的算術平均值0.509分為LncRNA NNT-AS1低表達38例，高表達39例，將隨訪結果制成圖1，LncRNA NNT-AS1低表達者生存率為68.42%(26/38)，生存時間為(52.03±3.11)個月，LncRNA NNT-AS1高表達者生存率為38.46%(15/39)，生存時間為(39.11±3.02)個月。胃癌組織中LncRNA NNT-AS1低表達者生存率與生存時間均優(yōu)于LncRNA NNT-AS1高表達者(χ2=6.939，P=0.008；t=18.495，P=0.000)。

圖1 LncRNA NNT-AS1低表達與高表達者Kaplan-Meier生存曲線

3 討論

我國胃癌發(fā)病率全球范圍內位居第二，僅次于日本，每年新增胃癌患者40萬例，占全世界的42%左右，居我國惡性腫瘤發(fā)病率第二位，病死人數(shù)約30萬例，病死率居我國因癌病死率第三位[1]。近年來，由于環(huán)境變化、幽門螺桿菌的感染、居民生活方式改變等原因，胃癌呈現(xiàn)年輕化趨勢[7]，嚴重威脅我國國民身體健康。胃癌可依據(jù)病理類型分為胃腺癌、胃黏液腺癌及胃印戒細胞癌，不同病理類型的胃癌患者的臨床病理特征有一定差異，但一般認為三種胃癌患者的預后差異無統(tǒng)計學意義，而目前的統(tǒng)計學數(shù)據(jù)顯示，晚期胃癌患者術后5年生存率均不超過30%[7]。早期診斷、明確診斷并據(jù)此制定合理的治療方案對患者預后至關重要，但我國以胃鏡為主要早期篩查手段漏診情況嚴重[8]。因此明確胃癌的發(fā)病機制，找到篩查依據(jù)及治療靶點對于改善胃癌患者預后尤為重要。

LncRNA是一類不編碼蛋白質的長度超過200 nt的功能性RNA，廣泛分布于細胞核與細胞質中，在轉錄、轉錄后調控及表觀遺傳學層面上調控基因表達[9]。隨著研究的深入，越來越多的證據(jù)表明LncRNA參與機體的諸多生物過程，更為重要的是，LncRNA具有成為腫瘤標記物的潛力[10]。已有許多LncRNA被證實與胃癌相關：LncRNA MEG3能通過p53信號通路抑制胃癌細胞的增殖與轉移[11]；LncRNA SNHG6通過沉默p27信號通路促進胃癌細胞的上皮-間質轉化作用，使患者預后惡化[12]；LncRNA SNHG1通過調控DNMT1表達，從而促進胃癌細胞增殖[13]。lncRNA BANCR在胃癌細胞中高表達，沉默lncRNA BANCR表達可抑制胃癌細胞的增殖、遷移能力。

本研究選擇的LncRNA NNT-AS1定位于人類5號染色體，是一種新發(fā)現(xiàn)的LncRNA。Wang等[15]結合體內與體外實驗發(fā)現(xiàn)，LncRNA NNT-AS1在結直腸癌組織中高表達，且能通過調控MAPK/ERK信號通路和腫瘤細胞的上皮-間質轉化，促進結直腸癌細胞的增殖、轉移與侵襲；Lu等[16]同樣通過對臨床腫瘤標本及體外細胞系的研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA NNT-AS1在肝細胞癌組織中高表達，通過miR-363/CDK6信號簇參與促進肝細胞癌的進展與轉移；Ye等[17]研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA NNT-AS1在骨肉瘤組織中異常高表達，且表達較高的患者組生存率與生存時間均較對照組差。本研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA NNT-AS1在胃癌組織中異常高表達，與前述其他惡性腫瘤中的表現(xiàn)一致，提示LncRNA NNT-AS1可作為惡性腫瘤的早期篩查指標，且胃癌組織中LncRNA NNT-AS1表達與腫瘤分化程度、TNM分期、脈管侵襲、淋巴結轉移密切相關，提示LncRNA NNT-AS1能促進胃癌細胞增殖與轉移，與前述研究中LncRNA NNT-AS1在其他惡性腫瘤中的作用相似，因此LncRNA NNT-AS1在多種惡性腫瘤中表現(xiàn)為促癌基因，可能成為新型抗癌手段的治療靶點。但本研究結果中LncRNA NNT-AS1表達與胃癌的神經(jīng)侵襲無關，可能因為LncRNA NNT-AS1對胃癌轉移的促進途徑與神經(jīng)細胞、神經(jīng)系統(tǒng)的基因表達無關，亦可能因本研究選擇的患者中僅16例發(fā)現(xiàn)胃癌的神經(jīng)侵襲，存在統(tǒng)計偏差。因此LncRNA NNT-AS1在胃癌中的作用機制尚需進一步實驗證實。

本研究隨訪調查結果顯示，LncRNA NNT-AS1表達較高的患者生存率、生存時間均劣于LncRNA NNT-AS1表達較低的患者，此可能與LncRNA NNT-AS1對于胃癌轉移的促進作用相關，因此LncRNA NNT-AS1可作為胃癌患者預后評估的指標。對于LncRNA NNT-AS1表達較高的患者，建議重視復診，加強監(jiān)控，適當增加其他輔助抗腫瘤手段，以改善患者預后。

綜上所述，胃癌組織中LncRNA NNT-AS1呈異常高表達，且與胃癌的惡性進展密切相關。LncRNA NNT-AS1表達較高的患者預后較差。因此LncRNA NNT-AS1具有成為胃癌早期診斷、預后評估相關腫瘤標記物的潛力。