陳奕彤，張斯然，張春波，金東日

(延邊大學(xué) 長白山生物資源與功能分子教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，化學(xué)系，吉林 延吉 133002)

蛋白質(zhì)的糖基化是真核細(xì)胞中最常見的翻譯后修飾，對(duì)蛋白質(zhì)的折疊、定位及運(yùn)輸有重要作用[1-4]。作為糖基化修飾的主要類型之一，天冬酰胺(Asn)殘基上的N-糖基化發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能，如參與細(xì)胞黏附、蛋白質(zhì)折疊和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生命過程[4]。人類許多疾病的發(fā)生和發(fā)展均與N-糖鏈結(jié)構(gòu)和表達(dá)量的改變有關(guān)[5-6]。因此，建立糖蛋白中N-糖鏈的分析方法對(duì)尋求疾病中有效的生物信息具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

糖蛋白N-糖鏈的常用分析過程為：首先用蛋白酶(如N-糖苷酶F)釋放糖蛋白的糖鏈，獲得糖鏈與蛋白混合物，然后對(duì)糖鏈進(jìn)行富集純化，最后對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。生物質(zhì)譜可對(duì)各種糖鏈進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，是解決糖鏈結(jié)構(gòu)的有效手段。糖鏈結(jié)構(gòu)研究中，采用電噴霧離子化-質(zhì)譜(ESI-MS)技術(shù)無需衍生化即能確定糖鏈的組成和結(jié)構(gòu)，但易受樣品盒溶劑中干擾物的影響，因此需進(jìn)行繁瑣的糖鏈分離、純化處理。常用的糖鏈富集純化方法有凝集素親合法、石墨碳柱固相萃取法等。凝集素親合法可以捕獲不同的糖鏈，但凝集素不能吸附所有類型的糖鏈。石墨碳柱存在操作繁瑣、重現(xiàn)性差、樣品損失大、成本高等缺陷。近年來，在線分析技術(shù)的發(fā)展使得聯(lián)用技術(shù)日趨完善，如氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)、液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)和毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜(CE-MS)等聯(lián)用技術(shù)無需過多的分離純化步驟，可直接將微量樣品上樣分析，更加有效地獲得相關(guān)的糖鏈結(jié)構(gòu)信息。但這些方法存在由于糖鏈本身不易質(zhì)子化、檢測靈敏度低和很難獲得糖蛋白糖鏈表達(dá)量改變信息等問題。化學(xué)衍生化方法是解決上述問題的有效方法之一。通過對(duì)糖鏈的衍生化，可增加糖鏈的疏水性使之易于在色譜柱上保留，提高糖鏈的質(zhì)譜靈敏度，還可以進(jìn)行糖鏈的相對(duì)定量分析[7-9]。但需要在實(shí)驗(yàn)過程中進(jìn)行額外的化學(xué)反應(yīng)，這不僅需要引入試劑，增加反應(yīng)步驟，還會(huì)產(chǎn)生副反應(yīng)。

前期研究中，本課題組合成了帶1個(gè)GlcNAc的同位素標(biāo)記受體(如PDPZ-Boc-Asn-GlcNAc，d8-PDPZ-Boc-Asn-GlcNAc等)[9]。本研究利用Endo-M N175Q能將天然糖肽(如SGP)中糖鏈轉(zhuǎn)移到糖鏈?zhǔn)荏w上的特性，以PDPZ-Boc-Asn-GlcNAc為糖鏈?zhǔn)荏w，建立了新的糖蛋白糖鏈分析方法，并將此方法應(yīng)用于糖蛋白N-糖鏈的分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

1260 HPLC系統(tǒng)聯(lián)用6460三重四極桿質(zhì)譜(美國Agilent Technologies)；HB-100恒溫金屬浴(杭州大和熱電子有限公司)；FD-LD-50低溫冷凍干燥機(jī)(上海比朗儀器有限公司)；H-1650電動(dòng)離心機(jī)(長沙湘林離心機(jī)儀器有限公司)。

DL-二流蘇糖醇(DTT)、三(羥甲基)氨基甲烷、鹽酸胍、甲酸銨、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、甲酸(色譜純)、乙二胺四乙酸二鈉購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司； 碘代乙酰胺(IAA)、碳酸氫銨購自北京百靈威科技有限公司；胎球蛋白(Fetuin)、胰核糖核酸酶B(RNase B)購自Sigma-Aldrich 公司；N-糖苷酶F(PNGase F)購自NEW ENGLAND Biolabs Inc；丙酮、乙腈等均為色譜純。d0/d8-PDPZ-Boc-Asn-GlcNAc按文獻(xiàn)合成[13]。

1.2 糖蛋白水解

取 3 mg 糖蛋白樣品(牛胰核糖核酸酶B、卵清蛋白、胎球蛋白) 溶于50 μL pH 8.5的Tris-HCl(含7 mol/L鹽酸胍和5 mmol/L EDTA)緩沖溶液中，加100 μL 1 mol/L DTT，65 ℃下反應(yīng)30 min，冷卻至室溫，加140 μL 0.5 mol/L IAA，室溫下反應(yīng)40 min，加 60 μL 1 mol/L DTT終止反應(yīng)。

將上一步變性后的反應(yīng)液過PD Mini G-25凝膠柱，除去鹽類等小分子物質(zhì)。用1 mL緩沖液洗脫，收集洗脫液并冷凍干燥8 h后，將樣品溶于50 μL pH 8.0碳酸氫銨緩沖液中，加胰蛋白酶10 μL(0.1 mg)，充分混合2 min，于37 ℃金屬浴中恒溫避光反應(yīng)20 h。

1.3 糖肽及SGP富集

向得到的酶解液中加入300 μL丙酮，于-25 ℃冰柜中放置至少16 h，然后以12 000 g離心15 min，立刻移除上清液，沉淀以氮?dú)獯蹈桑玫教请摹?/p>

分別取50 μL 4 mmol/L SGP溶液于3個(gè)2 mL離心管中，依次加入150、250、350 μL冷丙酮。于-25 ℃冰柜中放置20 h后，以12 000 g離心10 min，移除上清液，將底部沉淀用氮?dú)獯蹈伞?個(gè)離心管中分別加入50 μL 流動(dòng)相溶解樣品，用LC-MS進(jìn)行檢測。

1.4 Endo-M N175Q糖鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)

向用20 μL pH 6.5磷酸鈉緩沖液溶解的糖肽中加5 μL 1 mol/L d0-PDPZ-Boc-Asn-GlcNAc(或d8-PDPZ-Boc-Asn-GlcNAc)和 5 mU 5 μL Endo-M N175Q，在32 ℃金屬浴中進(jìn)行4 h酶促反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，加10 μL乙腈使酶失活，取2 μL反應(yīng)液進(jìn)行LC-MS分析。

1.5 LC-MS條件

色譜柱為YMC色譜柱(2.0 mm×150 mm，3 μm)；流動(dòng)相：A為10 mmol/L 甲酸銨溶液，B為乙腈；梯度洗脫程序：0～18 min,5%～53%B；18～28 min,53%B；28～33 min,53%～95%B；33～36 min,95%～5%B；36～45 min,5%B。流速為 0.2 mL/min，進(jìn)樣量為2 μL。

離子化條件：ESI電離源，正離子掃描，噴霧電壓 4 kV，霧化氣20 psi(1 psi≈6.9 kPa)，加熱氣30 psi，氣簾氣 25 psi，干燥氣流速10 L/min，干燥氣溫度350 ℃，四極桿溫度100 ℃，停留時(shí)間100 μs。全掃描模式，掃描范圍m/z100～1 200。數(shù)據(jù)處理軟件為Mass Hunter工作站B.06.06版軟件。

2 結(jié)果與討論

2.1 Endo-M N175Q酶促反應(yīng)標(biāo)記N-糖鏈

采用在前期研究中合成的易質(zhì)子化，且?guī)?個(gè)GlcNAc的糖基受體PDPZ-Boc-Asn-GlcNAc[9]，以PDPZ-Boc-Asn-GlcNAc和糖肽(如SGP)作為酶催化反應(yīng)的底物時(shí)，Endo-M N175Q酶促反應(yīng)可促使糖肽上的糖鏈釋放，并將其轉(zhuǎn)移至PDPZ-Boc-Asn-GlcNAc，得到糖鏈標(biāo)記物，從而增加了糖鏈的疏水性，便于色譜分析，并提高糖鏈的MS檢測靈敏度(圖1)。

2.2 丙酮加入量的選擇

糖肽和肽有微小的極性差異，糖肽的親水性強(qiáng)于一般的肽段。當(dāng)糖肽和肽的混合溶液中加入非極性溶劑時(shí)，極性大的糖肽會(huì)發(fā)生沉淀，而極性小的肽溶于非極性溶劑中，如Kawasaki等[14]用丙酮沉淀經(jīng)胰蛋白水解的α1-酸性糖蛋白(αAGP)酶解液中的糖肽，結(jié)果有90%以上的糖肽富集在沉淀中。由于酶解液中丙酮的加入量對(duì)糖肽富集效果至關(guān)重要，本實(shí)驗(yàn)以唾液酸糖肽(SGP)為糖肽模型，分別考察了丙酮體積為樣品體積的3、5、7倍時(shí)糖肽的富集效果。結(jié)果顯示，當(dāng)丙酮體積為樣品的5倍時(shí)，沉淀中檢測到的SGP的峰面積最大，因此選擇丙酮加入量為樣品體積的5倍。

2.3 糖蛋白N-糖鏈分析

2.3.1核糖核酸酶B以RNase B作為糖蛋白模型進(jìn)行胰蛋白酶解、丙酮沉淀糖肽。以富集分離得到的糖肽和PDPZ-Boc-Asn-GlcNAc為酶促反應(yīng)底物，進(jìn)行Endo-M N175Q酶轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)，得到N-糖鏈標(biāo)記物并進(jìn)行LC-MS檢測。為考察丙酮富集糖肽方法對(duì)糖蛋白N-糖鏈的檢測情況，以未經(jīng)丙酮處理的RNase B酶解液進(jìn)行糖鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)，僅檢測到M5N2和M6N2 ，而經(jīng)丙酮富集后的樣品(圖2)中可檢測到高甘露糖型糖鏈M5N2、M6N2、M7N2、M8N2和M9N2(M：甘露糖; N:N-乙酰葡糖胺)。每種糖鏈均以[M+2H]2+形式檢出，表明丙酮能夠有效沉淀糖肽和肽混合溶液中的糖肽，從而可避免大量存在的肽對(duì)N-糖鏈檢測的干擾。進(jìn)一步根據(jù)每種糖鏈的質(zhì)譜峰面積對(duì)糖鏈進(jìn)行相對(duì)定量分析，將M5N2豐度設(shè)為100%，5種高甘露糖型糖鏈M5N2、M6N2、M7N2、M8N2和M9N2的相對(duì)豐度依次為100%、95.94%、21.31%、15.9%、4.65%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[15]。

圖1 以SGP(糖基供體)和PDPZ-Boc-Asn-GlcNAc(糖基受體)為酶催化反應(yīng)底物的Endo-M N175Q酶糖鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)Fig.1 Reaction scheme for transglycosylation reaction between SGP(a donor) and PDPZ-Boc-Asn-GlcNAc( an acceptor) with Endo-M N175Q

圖2 RNase B的Endo-M N175Q酶促反應(yīng)產(chǎn)物N-糖鏈標(biāo)記物的EIC色譜圖(A)與MS圖(B)Fig.2 EIC chromatograms(A) and MS spectra(B) obtained from the transglycosylation reaction of glycans in RNase B with Endo-M N175Q and d0-PDPZ-Boc-Asn-GlcNAcM:mannose; N:N-acetylgluosamine

2.3.2牛胎球蛋白牛胎球蛋白是一種α糖蛋白，分子量為48.4 kDa，含有1條由341個(gè)氨基酸組成的肽鏈，N-糖基化位點(diǎn)在81、138和158 Asn位上，N-糖鏈含有二天線和三天線結(jié)構(gòu)。胎球蛋白N-糖鏈標(biāo)記物的LC-MS檢測結(jié)果見圖3。從提取離子色譜圖中可清晰地檢測到5條糖鏈M3N4G2Ac2、M3N4G2Ac3、M3N5G3Ac、M3N5G3Ac2、M3N6G4Ac4(G：半乳糖; Ac:N-乙酰神經(jīng)氨酸)，并經(jīng)MS確認(rèn)。M3N4G2Ac2以[M+2H]2+形式檢測；M3N4G2Ac3、M3N5G3Ac2、M3N6G4Ac4以[M+3H]3+形式檢測；M3N5G3Ac檢測到[M+2H]2+和[M+3H]3+的分子離子峰。以上結(jié)果表明，丙酮能夠有效沉淀糖蛋白酶解液中的糖肽，而且這些天然糖肽可作為酶促反應(yīng)底物，Endo-M N175Q能將糖肽的N-糖鏈轉(zhuǎn)移到受體上，從而在LC-MS上得到分離和檢測。

綜上所述，與常用的糖肽富集純化方法(如凝集親合法、石墨碳柱固相萃取法)相比，利用丙酮富集糖肽方法操作簡便、成本低、樣品損失少，同時(shí)能夠有效富集多種類型的糖肽。通過標(biāo)記糖鏈上易質(zhì)子化的基團(tuán)，不僅可有效分離糖鏈，而且提高了糖鏈的檢測靈敏度。另外，本方法利用同位素標(biāo)記試劑(如d0-PDPZ-Boc-Asn-GlcNAc/d8-PDPZ-Boc-Asn-GlcNAc)可對(duì)糖鏈進(jìn)行相對(duì)定量分析。

圖3 牛胎球蛋白的Endo-M N175Q酶促反應(yīng)產(chǎn)物N-糖鏈標(biāo)記物的EIC色譜圖(A)與MS圖(B)Fig.3 EIC chromatograms(A) and MS spectra(B) obtained from the transglycosylation reaction of glycopeptides in bovine fetuin with Endo-M N175Q and d8-PDPZ-Boc-Asn-GlcNAcM:mannose; N:N-acetylgluosamine; G:galactose; Ac:N-acetylneuraminic acid

3 結(jié) 論

本文首次利用丙酮富集技術(shù)和Endo-M N175Q轉(zhuǎn)糖基活性，建立了新的糖蛋白/糖肽N-糖鏈的分析方法。該方法較為簡便，可在溫和的條件下將帶特定基團(tuán)(如易質(zhì)子化，同位素標(biāo)記)的標(biāo)簽和糖肽的寡糖鏈直接連接，從而得到較好的糖鏈色譜分離和高靈敏質(zhì)譜檢測，可進(jìn)行糖鏈的相對(duì)定量分析。