王雨晴，陳 亮，賈福懷，鄭 鋅，李月琪，馬 勇，張海欣，王 憬，谷瑞增

(1.中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司 北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心，北京 100015；2.寧波御坊堂生物科技有限公司，浙江 寧波 315012；3.島津企業(yè)管理(中國(guó))有限公司，北京 100020)

肌肽(β-丙氨酰-L-組氨酸，Car)和鵝肌肽(β-丙氨酰-1-甲基-L-組氨酸，Ans)是動(dòng)物體內(nèi)的組氨酸二肽。肌肽類生物活性肽具有抗氧化能力，可以抑制體內(nèi)脂質(zhì)氧化以及蛋白質(zhì)的氧化和糖基化，并具有抗衰老、抗白內(nèi)障等功能[1-6]，主要存在于脊椎動(dòng)物的肌肉和大腦中，通常從家禽骨骼肌中提取[7]。天然提取肌肽和鵝肌肽可以滿足人們的保健需求，在特醫(yī)食品和保健食品領(lǐng)域已有應(yīng)用。因此，建立快速、可靠的肌肽和鵝肌肽的檢測(cè)方法十分必要。

目前肌肽和鵝肌肽的檢測(cè)尚無(wú)相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，組氨酸二肽類物質(zhì)的測(cè)定方法主要有高效液相色譜法、離子交換色譜法和毛細(xì)管電泳法。高效液相色譜法有效實(shí)現(xiàn)了肌肽和鵝肌肽的測(cè)定[8-9]，但該方法選用210 nm波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定，基線較高、易受到干擾，方法準(zhǔn)確度尚需考察。田穎剛等[10]用NH2柱分離測(cè)定肌肽含量并進(jìn)行質(zhì)譜(MS)驗(yàn)證，但利用液相色譜定量，目標(biāo)物質(zhì)準(zhǔn)確性有待進(jìn)一步確定。Gil-Agustí等[11]利用毛細(xì)管液相色譜測(cè)定肉類樣品中的肌肽和鵝肌肽，該方法需高純?cè)噭?，成本高，且?duì)樣品純度的要求很高，不利于肌肽和鵝肌肽含量的測(cè)定。利用離子交換色譜和毛細(xì)管電泳熒光檢測(cè)法分析肌肽和鵝肌肽含量的前處理較為復(fù)雜，對(duì)樣品分離純化要求較高，分離效果欠佳[12-13]。隨著分析技術(shù)的快速發(fā)展，利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)短肽進(jìn)行定性定量成為主流趨勢(shì)[14-15]。

本文利用超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法，以分子離子和碎片離子質(zhì)荷比定性，建立了一種簡(jiǎn)單、快速、可同時(shí)測(cè)定肌肽和鵝肌肽含量的方法，以滿足特醫(yī)食品、保健食品等領(lǐng)域動(dòng)物源提取物中肌肽和鵝肌肽含量的分析要求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜儀Nexera X2與三重四極桿質(zhì)譜儀聯(lián)用系統(tǒng)(日本島津公司)，包括：LC-30AD×2輸液泵，SIL-30AC自動(dòng)進(jìn)樣器，CTO-20AC柱溫箱，CBM-20A系統(tǒng)控制器，LCMS-8060三重四極桿質(zhì)譜儀，LabSolutions Ver.5.91色譜工作站。XS205DU分析天平(美國(guó)Mettler Toledo公司)；QL-901渦旋混合儀(其林貝爾儀器制造有限公司)。

標(biāo)準(zhǔn)品：肌肽購(gòu)于Sigma公司，鵝肌肽購(gòu)于蘇州強(qiáng)耀生物科技有限公司，純度均≥99%；乙腈(色譜純，德國(guó)Merck公司)；甲醇(色譜純，美國(guó)J.T.Backer公司)；甲酸(色譜純，迪馬科技有限公司)；乙酸(>99.99%，Sigma公司)；乙酸銨(質(zhì)譜純，Sigma公司)；實(shí)驗(yàn)所用超純水(18.2 MΩ·cm)由Milli-Q純水系統(tǒng)制備。

1.2 多肽標(biāo)準(zhǔn)品的配制

分別準(zhǔn)確稱取肌肽及鵝肌肽標(biāo)準(zhǔn)品粉末20.0 mg，加水溶解，渦旋混勻，定容至100 mL，即得200 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別取500 μL上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，定容至10 mL，即得10 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)中間工作液。將上述混合標(biāo)準(zhǔn)中間工作液用水逐級(jí)稀釋成1.95、3.91、7.81、15.63、31.25、62.5、125、250、500 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 肌肽、鵝肌肽提取物的制備

以富含肌肽和鵝肌肽的海洋魚和家禽為原料，先進(jìn)行破碎和調(diào)漿，調(diào)節(jié)溫度和pH值至最佳反應(yīng)條件進(jìn)行攪拌提取，離心后取上清液，濃縮后冷凍干燥，制成固體粉末狀低聚肽提取物樣品，分別為海洋魚低聚肽樣品A、B和家禽低聚肽樣品A、B、C、D。

1.4 樣品前處理

將“1.3”所述以海洋魚和家禽為原料制備的6個(gè)低聚肽樣品，用水分別配成20.0 g/L的溶液，以水稀釋104倍待測(cè)。

1.5 分析條件

液相色譜條件：Inertsil Amide HP(2.1 mm×100 mm,3 μm)色譜柱；流動(dòng)相：A為0.1% 乙酸水溶液，B為乙腈溶液；梯度洗脫程序：0～3.0 min,70%～55%B;3.0～4.0 min,55%B;4.0～4.2 min,55%～70%B;流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣體積：1 μL；柱溫：40 ℃。

質(zhì)譜條件：離子化模式：ESI+；離子噴霧電壓：4.5 kV；霧化氣(氮?dú)?流速：3.0 L/min；加熱氣(空氣)流速：10 L/min；干燥氣(氮?dú)?流速：10 L/min；脫溶劑管溫度：250 ℃；加熱模塊溫度：400 ℃；離子源溫度：300 ℃；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；駐留時(shí)間：100 ms；延遲時(shí)間：3 ms；MRM參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 目標(biāo)化合物的MRM優(yōu)化參數(shù)Table 1 The multiple reaction monitoring conditions of the analytes

*quantitative ions

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

肌肽和鵝肌肽均含有氨基，在酸性條件下易加氫形成[M+H]+，因此實(shí)驗(yàn)選擇ESI+模式分別對(duì)1 mg/L肌肽及鵝肌肽混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行一級(jí)全掃描，得到豐度較高且穩(wěn)定的前體離子，再利用儀器自動(dòng)優(yōu)化功能，篩選出二級(jí)產(chǎn)物離子信息，獲得產(chǎn)物離子和碰撞能量(CE)。結(jié)果表明，肌肽的酰胺鍵斷裂可得到m/z156.1的產(chǎn)物離子，組氨酸殘基脫羧得到m/z110.1的產(chǎn)物離子；鵝肌肽酰胺鍵斷裂得到m/z170.1的產(chǎn)物離子，經(jīng)脫羧和脫氨基得到m/z109.1的產(chǎn)物離子。一級(jí)質(zhì)譜及二級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1，肌肽和鵝肌肽的裂解途徑見(jiàn)圖2。肌肽選擇m/z227.1>110.1和227.1>156.1為檢測(cè)離子對(duì)，鵝肌肽選擇m/z241.1>109.1和241.1>170.1為檢測(cè)離子對(duì)，其他MRM檢測(cè)參數(shù)見(jiàn)表1。

圖1 肌肽和鵝肌肽混標(biāo)的一級(jí)(A)、二級(jí)(B,C)質(zhì)譜圖Fig.1 Precursor ions(A) and product ions(B,C) spectra of carnosine and anserineA.carnosine and anserine,B.carnosine,C.anserine

圖2 肌肽和鵝肌肽的質(zhì)譜裂解途徑Fig.2 MS fragmentation pathways of carnosine and anserine

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1色譜柱的選擇肌肽和鵝肌肽均屬于極性親水化合物，在常規(guī)C18色譜柱上很難保留，且二者的分子結(jié)構(gòu)只相差1個(gè)甲基，極性差異較小，分離難度大。本實(shí)驗(yàn)比較了親水性色譜柱CORTECS HILIC(2.1 mm×100 mm,2.7 μm)、Inertsil Amide HP(2.1 mm×100 mm,3 μm)以及適合極性化合物保留的反相色譜柱ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)對(duì)肌肽和鵝肌肽的分離效果。結(jié)果表明，T3反相色譜柱對(duì)肌肽和鵝肌肽難以實(shí)現(xiàn)保留；另兩種親水性色譜柱對(duì)肌肽和鵝肌肽均有保留，且Inertsil Amide HP柱保留時(shí)間的穩(wěn)定性更優(yōu)，因此實(shí)驗(yàn)選擇Inertsil Amide HP(2.1 mm×100 mm,3 μm)色譜柱進(jìn)行分離。

圖3 肌肽及鵝肌肽標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.95 μg/L)的定量離子流色譜圖Fig.3 Quantitative ion chromatograms of standard solution(1.95 μg/L)

2.2.2流動(dòng)相的優(yōu)化比較了甲醇-水、乙腈-水及流動(dòng)相中添加不同調(diào)節(jié)劑的分離效果。結(jié)果顯示，以甲醇為有機(jī)相時(shí)目標(biāo)化合物難以實(shí)現(xiàn)保留，而以乙腈為有機(jī)相時(shí)，目標(biāo)化合物的色譜峰形好、保留時(shí)間穩(wěn)定，因此實(shí)驗(yàn)選用乙腈作為有機(jī)相。在正離子化模式下，流動(dòng)相中加入酸性介質(zhì)有利于化合物的離子化，可增強(qiáng)目標(biāo)物的色譜峰響應(yīng)；加入緩沖鹽也有助于增加化合物的電離效果。因此，考察了流動(dòng)相中分別加入1 mmol/L乙酸銨、0.1%甲酸和0.1%乙酸的分離效果。結(jié)果表明，流動(dòng)相中加入乙酸銨后色譜峰響應(yīng)減弱；而加入0.1%乙酸較加入0.1%甲酸的色譜峰響應(yīng)更高，峰形更對(duì)稱，且分離度和靈敏度均能滿足測(cè)定要求。綜上，實(shí)驗(yàn)選擇乙腈和0.1%乙酸作為流動(dòng)相，此時(shí)目標(biāo)物的檢測(cè)靈敏度高，分離度好，且能有效改善色譜峰的拖尾現(xiàn)象。

在優(yōu)化的UHPLC-MS/MS條件下，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中肌肽和鵝肌肽的分離效果良好(圖3)。

2.3 系統(tǒng)殘留測(cè)試

在高濃度低聚肽樣品(500 μg/L)進(jìn)樣后，進(jìn)樣空白溶劑，考察肌肽及鵝肌肽的系統(tǒng)殘留情況。結(jié)果表明，高濃度低聚肽樣品分析后，系統(tǒng)無(wú)殘留現(xiàn)象。

2.4 線性范圍及靈敏度實(shí)驗(yàn)

將“1.2”所述系列濃度標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(1.95、3.91、7.81、15.63、31.25、62.5、125、250、500 μg/L)在優(yōu)化條件下進(jìn)行測(cè)定，外標(biāo)法定量。以質(zhì)量濃度(X,μg/L)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，肌肽和鵝肌肽的質(zhì)量濃度在1.95～500 μg/L范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r)均高于0.998。以3倍信噪比(S/N=3)計(jì)算檢出限(LOD)，以S/N=10計(jì)算定量下限(LOQ)，得肌肽和鵝肌肽的LOD分別為0.12、0.47 μg/L，LOQ分別為0.37、1.42 μg/L(表2)。

表2 肌肽和鵝肌肽的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)(r)、檢出限及定量下限Table 2 Regression equations,linear ranges,correlation coefficients(r),LODs and LOQs of carnosine and anserine

2.5 回收率與精密度

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，選擇肌肽及鵝肌肽含量相對(duì)較低的低聚肽樣品作為基質(zhì)。取10 μL不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入一定量的低濃度基質(zhì)，配制成2、20、200 μg/L加標(biāo)濃度，每個(gè)濃度平行6份。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定結(jié)果，計(jì)算加標(biāo)回收率(表3)。得肌肽的回收率為99.3%～109%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，n=6)為0.98%～1.1%；鵝肌肽的回收率為100%～113%，RSD為1.0%～1.1%。

表3 加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 3 Recoveries and RSDs of spiked samples(n=6)

表4 實(shí)際樣品的測(cè)定結(jié)果Table 4 Analytical results of real samples

2.6 實(shí)際樣品的測(cè)定

取“1.3”自制的6個(gè)低聚肽樣品，在優(yōu)化條件下進(jìn)行測(cè)定，典型樣品家禽低聚肽樣品B的色譜圖見(jiàn)圖4，各低聚肽樣品中肌肽和鵝肌肽的含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果表明，相同低聚肽樣品中鵝肌肽的含量均高于肌肽，以家禽為原料提取的低聚肽樣品中肌肽和鵝肌肽的含量均高于以海洋魚為原料提取的低聚肽樣品。

圖4 家禽低聚肽樣品B的色譜圖Fig.4 Chromatograms of poultry sample B

3 結(jié) 論

本研究利用UHPLC-ESI-MS/MS技術(shù)，建立了動(dòng)物源提取物中肌肽及鵝肌肽的測(cè)定方法。結(jié)果表明，肌肽和鵝肌肽在1.95～500 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢出限分別為0.12、0.47 μg/L。該方法回收率高、精密度良好、準(zhǔn)確度高，能滿足肌肽及鵝肌肽的定量測(cè)定要求。本方法對(duì)于特醫(yī)食品、保健食品和藥食同源類產(chǎn)品的研發(fā)和生產(chǎn)具有重要意義。