楊儀尊 ，平 原

（1.復旦大學生命科學學院，上海 200438；2.上海市公安局物證鑒定中心 法醫(yī)物證學現(xiàn)場應用技術(shù)公安部重點實驗室 上海市現(xiàn)場物證重點實驗室，上海 200083）

短串聯(lián)重復（short tandem repeat，STR）序列在人類基因組中因多態(tài)信息含量高、數(shù)量豐富，適用于常見生物檢材的分析檢驗。目前采用毛細管電泳（capillary electrophoresis，CE）方法獲得STR分型被廣泛應用于法醫(yī)DNA實驗室中[1-3]，但CE方法僅能檢測STR序列的長度多態(tài)性，無法獲得基因座序列多態(tài)性信息。應用二代測序（next generation sequencing，NGS）技術(shù)對STR基因座進行分型是目前法醫(yī)遺傳學領(lǐng)域的研究熱點，由于其可同時獲得STR長度多態(tài)性及序列多態(tài)性的遺傳信息，從而提高STR基因座的個體識別能力，具有良好的應用前景[4-11]。目前，二代測序技術(shù)的兩大主流測序平臺為美國Illumina公司的MiSeq系列測序平臺和美國Thermo Fisher Scientific公司的Ion Torrent系列測序平臺。本研究利用Ion Torrent個體化操作基因組測序平臺（personal genome machine，PGM），對中國漢族165名無關(guān)個體在CSF1PO和D18S51基因座的遺傳多態(tài)性進行研究，為二代測序技術(shù)應用于法醫(yī)遺傳學相關(guān)研究提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集與DNA提取

采集165名無親緣關(guān)系的中國漢族人群志愿者外周血樣本，所有研究對象均根據(jù)知情同意原則簽署知情同意書。應用QIAamp DNA Mini試劑盒（德國QIAGEN公司）在BioRobot EZ1工作站（德國QIAGEN公司）上提取基因組DNA，所有操作按說明書進行。用QubitTMdsDNA HS Assay試劑盒和Qubit?2.0熒光計（美國Thermo Fisher Scientific公司）進行DNA定量。

1.2 STR復合擴增

采用Primer3Plus工具設(shè)計CSF1PO和D18S51基因座的引物，使用美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的 BLAST?（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行引物特異性驗證[12]，引物序列見表1。使用QIAGEN Multiplex PCR試劑盒（德國QIAGEN公司）進行PCR擴增，反應體系為 20μL，包括：復合引物（0.2μmol/L）各 0.5μL，2×PCR 反應混合物 10μL，DNA 模板 1ng，加水補至 20 μL。 PCR 反應條件：95℃ 10 min；94℃30s，61℃ 90s，72℃ 60s，10 個循環(huán)；94℃ 30s，59℃90 s，72℃ 60 s，20 個循環(huán)；60 ℃ 30 min；4℃保存。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。PCR產(chǎn)物采用Agemourt AMPure XP磁珠（美國Beckman Coulter公司）純化后采用QubitTMdsDNA HS Assay試劑盒和Qubit?2.0熒光計進行定量檢測。

表1 CSF1PO和D18S51基因座的引物序列

1.3 文庫構(gòu)建

純化后的PCR產(chǎn)物采用Ion Plus Fragment Library試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司）進行末端修復，磁珠純化后使用Ion XpressTMBarcode Adapters試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司）添加標簽序列接頭（Barcode）和公用接頭（P1 adapter）構(gòu)建文庫。文庫在磁珠純化后使用High Sensitivity DNA Analysis試劑盒（美國Agilent公司）在2100 Bioanalyzer Instruments（美國Agilent公司）上對回收的文庫質(zhì)量進行檢測。檢測后的DNA片段加入通用測序擴增引物進行擴增富集，磁珠純化后采用QubitTMdsDNA HS Assay試劑盒和Qubit?2.0熒光計進行定量檢測，根據(jù)結(jié)果將樣本的擴增產(chǎn)物等量混合。操作過程參照Thermo Fisher Scientific公司官方網(wǎng)站中提供的Ion Torrent操作手冊。

1.4 乳液PCR與測序

采用Ion PGMTMHi-QTMOT2試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司）在Ion OneTouchTM2系統(tǒng)上進行乳液PCR，將反應文庫與測序微珠連接并擴增，反應完成后通過Ion OneTouchTM富集系統(tǒng)進行微珠富集，同時去除未連接文庫的空微珠[13]。根據(jù)測序通量選擇相應的Ion TorrentTM芯片——Ion 318 v2（美國Thermo Fisher Scientific公司），采用Ion PGMTMHi-QTMSequencing試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司）按照產(chǎn)品說明書配制測序體系，在Ion Torrent PGMTM測序平臺上進行測序反應。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用配套的Torrent SuiteTMv5.0.2軟件（美國Thermo Fisher Scientific公司）對電信號進行捕獲和轉(zhuǎn)換，按照以下步驟完成等位基因檢驗：（1）篩選出測序所得序列兩端與引物序列能夠完全匹配的數(shù)據(jù)；（2）序列核心重復區(qū)域中1bp替換也一并納入，以獲得更多的遺傳多態(tài)性信息；（3）根據(jù)核心重復區(qū)域序列進行聚類，以讀取各STR基因座的等位基因，對核心區(qū)域序列相同但測序方向不同的序列進行合并，并統(tǒng)計各等位基因所得的序列數(shù)目，結(jié)合Torrent SuiteTMv5.0.2 和 Integrative Genomics Viewer（IGV，加利福尼亞大學研究部）軟件對測序結(jié)果進行初步分析，得到整體數(shù)據(jù)量、變異信息、平均測序深度等[14]。測序深度次數(shù)定義為一次實驗中某等位基因被檢出的次數(shù)；等位基因覆蓋率定義為當樣本在同一基因座上檢測得到的兩個等位基因不相同時，這兩個等位基因的序列數(shù)目之比[15]；等位基因比例定義為樣本等位基因的序列數(shù)目與總的序列數(shù)目之比[16]；stutter比例定義為比樣本目標等位基因少一個重復單位或多一個重復單位的等位基因序列數(shù)目與總的序列數(shù)目之比[17]。運用PowerState v12軟件（美國Promega公司）對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，獲得CSF1PO和D18S51基因座的個體識別率（discrimination power，DP）、多態(tài)信息含量（polymorphic information content，PIC）、二聯(lián)體非父排除率（probability of paternity exclusion in duos，PEduo）、三聯(lián)體非父排除率（probability of paternity exclusion in trios，PEtrio）等群體遺傳學參數(shù)。

1.6 基于CE方法的常染色體STR檢驗

應用GlobalFilerTMExpress PCR擴增試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司）在9700型PCR儀（美國AB公司）上進行擴增，反應體系及反應條件按照試劑盒說明書進行。用3500xL基因分析儀（美國AB公司）進行CE，由Data Collection軟件收集數(shù)據(jù)，使用GeneMapperTMv3.0軟件進行STR分析獲取分型結(jié)果，該STR分型結(jié)果用于和Ion Torrent PGMTM測序平臺的檢測結(jié)果進行比較。

1.7 Sanger測序驗證

針對Ion Torrent PGMTM測序平臺檢測中發(fā)現(xiàn)的新的等位基因，采用Sanger測序法進行驗證。測序反應體系及反應條件遵照BigDyeTMTerminator v3.1 Cycle Sequencing試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司）的說明書進行，PCR產(chǎn)物使用3500xL基因分析儀進行電泳檢測。

2 結(jié) 果

本研究應用二代測序技術(shù)對165名中國漢族無關(guān)個體的樣本進行了測序，所有樣本在CSF1PO和D18S51基因座都擴增成功，測序結(jié)果中大于50×以上測序深度的基因型位點均納入分析[18]。CSF1PO和D18S51基因座的測序深度、等位基因覆蓋率、等位基因比例、stutter比例分別通過計算得到，結(jié)果見表2。

表2 CSF1PO和D18S51基因座的測序結(jié)果 （n=165，±s）

表2 CSF1PO和D18S51基因座的測序結(jié)果 （n=165，±s）

基因座 測序深度次數(shù)stutter比例/%CSF1PO 981±446 60.3±21.6 73.8±5.3 5.4±2.7 D18S51 1205±526 62.7±15.7 69.3±4.1 6.5±2.9等位基因覆蓋率/%等位基因比例/%

實驗結(jié)果中STR等位基因的命名按照國際法醫(yī)遺傳學會（International Society of Forensic Genetics，ISFG）推薦的命名法[19]及 STRBase（SRD-130，https://strbase.nist.gov/index.htm）數(shù)據(jù)庫現(xiàn)有的命名原則進行。本研究應用Ion Torrent PGMTM測序平臺得到的CSF1PO和D18S51基因型與PCR-CE方法得到的基因型一致，其中4例樣本的等位基因具有相同的序列長度但核心重復序列結(jié)構(gòu)有差異。Ion Torrent PGMTM測序平臺獲得的165名中國漢族無關(guān)個體CSF1PO和D18S51基因座的等位基因序列信息和頻率見表3。

表3 CSF1PO和D18S51基因座的等位基因序列信息和頻率 （n=165）

續(xù)表3

應用二代測序技術(shù)檢測觀察到CSF1PO和D18S51基因座具有長度相同但核心重復序列不同的等位基因3種，采用Sanger測序法對其進行驗證，驗證結(jié)果均與采用Ion Torrent PGMTM測序平臺檢測得到的結(jié)果一致。該3種等位基因核心重復序列的Sanger測序驗證圖見圖1。

采用PCR-CE法和二代測序技術(shù)檢測分別獲得CSF1PO和D18S51基因座的等位基因，運用PowerState v12軟件計算得到群體遺傳學參數(shù) DP、PIC、PEduo、PEtrio，詳見表4。結(jié)果顯示：與CE方法相比較，運用二代測序技術(shù)進行檢測，CSF1PO的DP由0.891提高至0.893，PIC 由 0.701提高至 0.704，PEduo由 0.376提高至 0.387，PEtrio由 0.472 提高至 0.482；D18S51 的 DP由 0.955提高至 0.956，PIC由 0.820提高至 0.832，PEtrio由 0.511提高至 0.527，PEtrio由 0.622提高至0.633。

圖1 CSF1PO和D18S51基因座的Sanger測序驗證圖

表4 CSF1PO和D18S51基因座采用兩種技術(shù)得到的群體遺傳學參數(shù) （n=165）

3 討 論

本研究基于Ion Torrent PGMTM測序平臺進行高通量序列檢測，僅使用一塊Ion 318 v2芯片，可一次對幾百萬條DNA分子進行序列測定，實現(xiàn)了大規(guī)模并行測序。Ion Torrent PGMTM測序結(jié)果顯示：在165例樣本的CSF1PO基因座中，有2例在第6個核心重復序列發(fā)生了堿基置換（A→G），產(chǎn)生新的等位基因（[ATCT]5GTCT[ATCT]6），CHURCHILL 等[20]也 報 道 了該種新的等位基因；在165例樣本的D18S51基因座中，1例在第10個核心重復序列發(fā)生了堿基置換（A→G），產(chǎn)生新的等位基因（[AGAA]9AGGA[AGAA]3），另1例在第18個核心重復序列發(fā)生了堿基置換（A→G），產(chǎn)生新的等位基因（[AGAA]17AGAG[AGAA]3）。應用二代測序技術(shù)既獲得了CSF1PO和D18S51基因座的長度多態(tài)性信息以兼容傳統(tǒng)的PCR-CE分型結(jié)果，同時又獲得了CSF1PO和D18S51基因座的序列多態(tài)性信息，使具有相同長度的基因座通過核心重復序列的結(jié)構(gòu)差異而得以區(qū)分。采用PowerState v12軟件計算得到PCR-CE和二代測序技術(shù)兩種檢測方法的遺傳學參數(shù)（DP、PIC、PEduo、PEtrio），比較發(fā)現(xiàn) CSF1PO和 D18S51 基因座的 DP、PIC、PEduo、PEtrio均有所提高，表明CSF1PO和D18S51基因座的識別效能提高，為未來探索解決混合斑檢驗、復雜親緣關(guān)系鑒定等法醫(yī)學疑難問題提供了全新的思路。

本研究為使Ion Torrent PGMTM測序平臺生成的基因座數(shù)據(jù)信息和PCR-CE法檢測生成的基因座數(shù)據(jù)信息有效對接，采用了第26屆ISFG會議提出的建議[19]：（1）導出CSF1PO和D18S51基因座核心重復序列的FASTA格式信息并形成數(shù)據(jù)庫，獲取等位基因的頻率信息；（2）CSF1PO和D18S51基因座的等位基因命名全部按照最新參考序列GRCh38進行命名，命名次序為STRBase數(shù)據(jù)庫使用的基因座名稱和重復次數(shù)，染色體編號和使用的參考基因組版本號，核心序列的起始和終止位置，具體重復序列。

隨著商業(yè)化試劑盒的開發(fā)，二代測序技術(shù)可應用于常染色體和性染色體STR多位點并行檢測、單核苷酸多態(tài)性分析以及線粒體全序列測定等[13，21-25]，在法醫(yī)遺傳學研究上具有廣闊的空間和多樣化的前景，為偵破刑事案件提供了更多方法上的選擇。但就目前而言，將其應用到法庭科學常規(guī)檢測中還有一定的限制：（1）應用二代測序技術(shù)較PCR-CE方法檢測在原理和應用上有很大的更新，實驗流程比較繁瑣，實驗耗時較長；（2）應用二代測序技術(shù)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)信息量高達幾千兆甚至更多，數(shù)據(jù)分析較為復雜，對技術(shù)人員的操作水平及分析能力要求較高；（3）法醫(yī)DNA實驗室現(xiàn)有的儀器設(shè)備投入使用時間不長，短期內(nèi)不可能全部替換。未來，隨著案件樣本的復雜性、多樣性及總數(shù)量增加，采用信息含量更多、數(shù)據(jù)準確性更高的新技術(shù)替代傳統(tǒng)的DNA檢驗技術(shù)是學科發(fā)展的必然趨勢，但仍需要大量的研究工作加以評估。