周夢珍，歐惠算，邱瑞瑾，龍志榮，張靈枝*

（1.華南農業(yè)大學園藝學院，廣東廣州 510642；2.廣東省粵東技師學院，廣東汕頭 515041；3.梧州市六堡茶研究院，廣西梧州 543000；4.梧州市茶產業(yè)發(fā)展辦公室，廣西梧州 543000）

六堡茶是廣西特有的歷史名茶，是經渥堆、蒸壓、晾置、陳化等工藝制成的后發(fā)酵茶，屬于黑茶類[1]。隨著黑茶的發(fā)展，黑茶的安全問題受到廣泛關注，對黑茶中微生物的研究成為熱點，同時也推動了對六堡茶中微生物的研究。溫志杰等[2]分析了六堡茶渥堆過程中微生物種群的變化，檢測到該過程中有大量的細菌、酵母、霉菌；歐惠算等[3]發(fā)現六堡茶汽蒸后有酵母、青霉和曲霉等微生物存在；陳慶金等[4]用Miseq測序分析在屬上對六堡茶陳化初期微生物進行鑒別，結果表明六堡茶陳化初期微生物以曲霉屬、散囊屬為主。目前對六堡茶陳化后期微生物的研究較少，陳化是六堡茶品質形成的關鍵工序，且六堡茶耐于久藏，越陳越香[5]。有研究表明，六堡茶在陳化過程中主要生化成分含量及香氣物質含量均發(fā)生一定的變化，經過適當時間貯存的六堡茶，其品質得到提高和純化，六堡茶的飲用價值也得到了提高[6-7]。研究選取梧州茶廠六堡散茶進行優(yōu)勢真菌的分離鑒定，對六堡茶陳化中后期過程中微生物與品質關系的機理進行初探，從而改進六堡茶的陳化工藝，為提高產品質量提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

六堡茶茶樣來自廣西梧州茶廠，分別陳放2年、4年、6年、8年的特級六堡茶散茶。

分離培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基、20%蔗糖查氏瓊脂培養(yǎng)基；純化鑒定培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基、20%蔗糖查氏瓊脂培養(yǎng)基、改良的20%蔗糖查氏瓊脂培養(yǎng)基（加入2%的六堡茶毛茶茶湯）。

1.2 實驗方法

1.2.1 茶樣中真菌的分離純化

菌懸液的制備：分別稱量2年、4年、6年、8年的茶樣各10 g，用剪刀將茶梗、茶葉剪碎，放入250 mL的錐形瓶中，量取90 mL無菌蒸餾水，加入錐形瓶中。將錐形瓶置于振蕩器上震蕩15 min，制成10-1倍的菌懸液。在無菌的超凈工作臺上用移液槍吸取1 mL的菌懸液置于另一支裝有9 mL的無菌水試管中，充分混勻，得到10-2倍的稀釋液菌懸液，依次類推，至得到10-6倍的稀釋菌懸液。

菌的分離培養(yǎng)：用移液槍分別取1 mL的10-2～10-6的稀釋菌懸液置于平板培養(yǎng)基上，然后用無菌的三角玻璃棒劃“十”和“（）”，每個濃度各進行3次重復，再取2組1 mL無菌水置于平板培養(yǎng)基上，用無菌的三角玻璃棒均勻涂布，作為對照試驗。將實驗組和對照組的平板培養(yǎng)基放到30°C的培養(yǎng)箱內恒溫培養(yǎng)7 d。

菌純化：根據各菌種在分離培養(yǎng)基上的生長情況，為各菌挑選適合其生長的培養(yǎng)基。用挑種針挑取少量菌絲，采用劃線法再進行多次分離純化培養(yǎng)得到純種菌株并編號，接著用15 mL大試管斜面培養(yǎng)，于冰箱內4°C環(huán)境下保存菌種。

1.2.2 菌株的形態(tài)學觀察

將保存的菌種取出，置于30°C恒溫培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng)24 h后，用三點接種法將菌種接到適宜的純化鑒定平板培養(yǎng)基上，倒置于30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，取出拍照并觀察菌落的顏色、質地、有無滲出液等菌落特征。菌株顯微鏡觀察：用插片法觀察，將無菌的蓋玻片大約傾斜45°左右插入PDA培養(yǎng)基、20%蔗糖查氏培養(yǎng)基和改良的20%蔗糖查氏培養(yǎng)基中。待菌絲長到蓋玻片上，取出蓋玻片置于載玻片上在光學顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3 菌株的DNA序列分析

用平板劃線法對菌株進行培養(yǎng)7 d后，送往上海生工技術有限公司，提取基因組DNA，應用引物ITS1和ITS4擴增真菌核糖體RNA基因的轉錄間隔區(qū) （ITS），測定序列，將得到的序列在NCBI中使用Blastn軟件進行核酸-核酸的同源序列比對，取相似度97%及以上的前幾個序列作為鑒定參考序列。用MEGA 6.06軟件構建供試菌與參考菌的系統(tǒng)發(fā)育樹，選用鄰接法 （Neighborjoining，NJ），用自展（Bootstrap）做驗證進化樹分析，隨機自檢率設置為1000，其余保持默認設置。

2 結果與分析

2.1 菌株的形態(tài)鑒定

在選取的4種梧州茶廠六堡散茶中，分離純化后得到9種真菌，其形態(tài)特征如表1所示。

表1 菌株的形態(tài)特征及初步鑒定Table 1 Morphological characteristics and preliminary identification of fungal strains

續(xù)表

圖1 wz1-2菌株的菌落形態(tài)特征和顯微結構Fig.1 Morphological characteristics and microstructure of wz1-2 strain

圖2 wz4-2菌株的菌落形態(tài)特征和顯微結構Fig.2 Morphological characteristics and microstructure of wz4-2 strain

圖3 wz2-3菌株的菌落形態(tài)特征和顯微結構Fig.3 Morphological characteristics and microstructure of wz2-3 strain

圖4 wz4-3菌株的菌落形態(tài)特征和顯微結構Fig.4 Morphological characteristics and microstructure of wz4-3 strain

圖5 HUQ2菌株的菌落形態(tài)特征和顯微結構Fig.5 Morphological characteristics and microstructure of HUQ2 strain

圖6 wz2-2菌株的形態(tài)特征和顯微結構Fig.6 Morphological characteristics and microstructure of wz2-2 strain

圖7 wz2-1B菌株的菌落形態(tài)特征和顯微結構Fig.7 Morphological characteristics and microstructure of wz2-1B strain

圖8 jinhua4菌株的菌落形態(tài)特征和顯微結構Fig.8 Morphological characteristics and microstructure of jinhua4 strain

圖9 jinhua6菌株的形態(tài)特征和顯微結構Fig.9 Morphological characteristics and microstructure of jinhua6 strain

2.2 菌株的分子鑒定

將六堡茶中分離出的9種真菌進行DNA序列分析，分子鑒定的結果如表2所示，菌株wz2-3、wz4-3 和菌株 wz2-1、wz4-2、HUQ2、wz2-2、wz2-1B、jinhua4、jinhua6 的 ITS 序列系統(tǒng)發(fā)育樹（NJ）分別如圖10、圖11所示。

表2 六堡茶中真菌的分子鑒定Table 2 Molecular identification of fungal species isolated from Liupao Loose Tea

圖10 菌株（wz2-3、wz4-3）ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹（NJ）Fig.10 Phylogenetic tree of fungal ITS sequences of strains wz2-3 and wz4-3

圖11 菌株（wz1-2、wz4-2、HUQ2、wz2-2、wz2-1B、jinhua4、jinhua6）ITS 序列的系統(tǒng)發(fā)育樹（NJ）Fig.11 Phylogenetic tree of fungal ITS sequences of strains wz1-2， wz4-2， HUQ2， wz2-2， wz2-1B，jinhua4 and jinhua6

2.3 鑒定最終結果

研究結合形態(tài)學鑒定與分子學鑒定的方法，最終將六堡茶中分離出的9種真菌鑒定為：Penicillium sclerotiorum （菌核青霉）、Penicillium jiangxiense（江西青霉）、Aspergillus amstelodami（阿姆斯特丹曲霉，Eurotium amstelodam （阿姆斯特丹散囊菌）的異名[11]）、Aspergillus ruber（赤曲霉，Eurotium rubrum（赤散囊菌）的異名[11]）、Aspergillus versicolor（雜色曲霉變種）、Cladosporium oryzae（稻枝 孢 ）、Cladosporium asperulation、Cladosporium cladosporioides （枝狀枝孢）、Pseudocercospora fici（無花果假尾孢）。

3 討論

菌株進行形態(tài)鑒定時，對培養(yǎng)條件要求非常嚴格，培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度的不同，都會使菌落形態(tài)特征產生差異，而且對于某些同源性較高的菌株，其形態(tài)特征非常相似，以形態(tài)學的表征去鑒定菌株容易誤判[13]。ITS全新標記具有快速、準確和高效特異性的特點，現廣泛用于真菌屬種的鑒別[14-15]。研究采取分子手段結合傳統(tǒng)形態(tài)學特征對菌株進行鑒定，使鑒定結果更加可靠。

胡治遠等[16]從18個不同品種茯磚茶中分離出主要優(yōu)勢真菌為冠突散囊菌，并從貯藏30年的老茯磚茶中分離出冠突散囊菌、謝瓦式曲霉、蠟葉散囊菌、阿姆斯特丹散囊菌、肋狀散囊菌。普洱茶貯藏時的主要優(yōu)勢真菌是黑曲霉和青霉屬真菌，還有少量其他種屬真菌[17-19]。六堡茶貯藏時主要優(yōu)勢真菌為曲霉屬、散囊屬和青霉屬的真菌，還有酵母屬真菌[4，20-21]。研究從六堡散茶中分離出的主要優(yōu)勢真菌是曲霉屬、散囊菌屬真菌，還有青霉屬、枝孢屬、假尾孢屬真菌等腐生真菌，這些真菌均為環(huán)境常見真菌，未發(fā)現特殊的真菌和致病菌。

研究表明阿姆斯特丹散囊菌是茶葉中的金花菌[16，22-24]。“金花”菌對黑茶品質的形成有重要的作用，能夠分泌淀粉酶和氧化酶，將茶葉中的淀粉水解為單糖，將多酚類物質氧化成一系列氧化產物，從而消除了茶葉粗老氣味，降低茶葉苦澀味，使茶湯呈紅棕色，滋味更加醇和[25-27]。

枝孢屬和假尾孢屬真菌是植物病原菌，分布廣泛，可以從土壤、空氣及各種有機質中分離得到[10-12]。李小容[28]對茶樹葉面真菌與內生真菌進行分離鑒定，發(fā)現鮮葉表面上有Cladosporium cladosporioides。普洱茶發(fā)酵和貯藏中也有Cladosporium cladosporioides[29-30]。目前對枝孢屬和假尾孢屬的研究較少，有待進一步研究枝孢屬和假尾孢屬是否會產生潛在毒素。