杜穎穎 ， 葉美君 ， 劉相真

（1.中華全國(guó)供銷合作總社杭州茶葉研究院，浙江杭州 310016；2.國(guó)家茶葉質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，浙江杭州 310016；3.浙江省茶資源跨界應(yīng)用技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州 310016）

茶葉是全球三大飲品之一，也是幾千年來(lái)中國(guó)人日常生活中不可或缺的一部分，其品質(zhì)與茶產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益及民眾的健康息息相關(guān)。氨基酸對(duì)人體的營(yíng)養(yǎng)吸收和生理發(fā)育有重要影響，是茶葉化學(xué)組分中的重要組成部分，也是茶葉品質(zhì)的重要評(píng)價(jià)因子之一。

茶葉中含有20多種氨基酸，其氨基酸的組成、含量及其降解產(chǎn)物和轉(zhuǎn)化產(chǎn)物以及這些組分間的含量變化將直接影響茶葉的香氣和滋味。茶葉中的氨基酸包括中性氨基酸，如甘氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、半氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、絲氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸等；酸性氨基酸，如谷氨酸和天門冬氨酸，堿性氨基酸，如精氨酸、組氨酸和賴氨酸。茶氨酸是茶葉中特有及最主要的游離氨基酸，它具有類似味精的鮮爽和焦糖香氣，對(duì)茶湯的滋味和香氣均有良好的作用[1]，它可緩解茶的苦澀味，增強(qiáng)其甜味[2-3]，也是綠茶鮮爽滋味的主要來(lái)源[4-6]。其它的氨基酸如谷氨酸和天門冬氨酸具有鮮味，精氨酸具有鮮甜滋味。茶葉中各氨基酸組分具有各自的風(fēng)格特征，而且它們之間還會(huì)產(chǎn)生協(xié)同作用，如茶氨酸可與谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸和脯氨酸等協(xié)同增強(qiáng)茶的鮮味，還可以協(xié)調(diào)咖啡堿和兒茶素引起的苦澀味[5]。因此，茶葉中的游離氨基酸分析對(duì)于茶葉品質(zhì)鑒定具有十分重要的意義。

經(jīng)過(guò)多年研究，已有多種游離氨基酸分析檢測(cè)技術(shù)在各領(lǐng)域得以應(yīng)用?，F(xiàn)對(duì)游離氨基酸分析檢測(cè)技術(shù)在茶葉中的應(yīng)用研究進(jìn)展進(jìn)行探討。

1 茶葉中游離氨基酸總量的測(cè)定方法

茚三酮比色法是目前測(cè)定游離氨基酸總量所采用的常規(guī)方法，也是GB/T 8314—2013《茶 游離氨基酸總量測(cè)定》中所采用的檢測(cè)方法。該法的原理是：在pH 8的條件下，茶葉中的氨基酸與茚三酮發(fā)生共熱生成氨，氨和還原型茚三酮發(fā)生反應(yīng)，形成紫色絡(luò)合物，該化合物可通過(guò)分光光度計(jì)在波長(zhǎng)570 nm處測(cè)定吸光度，氨基酸濃度與吸光值呈正比[7]。

此法要求的設(shè)備相對(duì)簡(jiǎn)單，但只適用于茶葉中游離氨基酸總量的測(cè)定，不能檢測(cè)茶葉中各游離氨基酸組分的含量。而且在以前的應(yīng)用中，研究者們發(fā)現(xiàn)在舊版標(biāo)準(zhǔn)GB/T 8314—2002中存在疑問(wèn)[8-10]：（1）用茶氨酸或谷氨酸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線只能代表茶氨酸或谷氨酸的濃度值，而不能完全代表游離氨基酸的濃度值，運(yùn)用這兩者繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算游離氨基酸總量，結(jié)果會(huì)有差異。茶氨酸是茶葉中最主要的氨基酸，建議在繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，盡量選用茶氨酸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；（2）氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制作中添加的水和茚三酮含量與樣品測(cè)定時(shí)有差異。如在標(biāo)準(zhǔn)曲線制作時(shí)，在容量瓶中加水4 mL，而在樣品測(cè)定時(shí)無(wú)此步驟。在標(biāo)準(zhǔn)曲線制作時(shí)，加緩沖液2 mL，而在樣品測(cè)定時(shí)，加緩沖液0.5 mL。

為提高此法的準(zhǔn)確度，對(duì)GB/T 8314—2002進(jìn)行了修訂，在現(xiàn)行的GB/T 8314—2013中，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線與樣品測(cè)定操作步驟一致，修正了舊版標(biāo)準(zhǔn)中的不足之處。

2 茶葉中游離氨基酸組分的檢測(cè)方法

隨著研究的深入，只確定游離氨基酸總量已經(jīng)滿足不了研究的需求，測(cè)定茶葉中氨基酸各組分含量的多種方法隨之開(kāi)展。根據(jù)氨基酸的特性，可將這些方法劃分為衍生化分析技術(shù)法和非衍生化分析技術(shù)法。

2.1 茶葉中氨基酸衍生化分析技術(shù)法

氨基酸結(jié)構(gòu)（見(jiàn)圖1）特點(diǎn)在于每個(gè)氨基酸分子中至少有一個(gè)氨基和一個(gè)羧基，并且鏈接在同一個(gè)碳原子上，各種氨基酸之間的區(qū)別在于R基的不同。由此可知氨基酸分析具有兩大特點(diǎn)：一是除酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸等含有苯環(huán)的氨基酸以外，絕大部分氨基酸不具備生色團(tuán)，無(wú)法用分光光度法直接檢測(cè)；二是部分氨基酸極性較大，不易反相分離。因此需要利用氨基酸分子中的氨基、羧基或其它活性基團(tuán)與衍生化試劑發(fā)生反應(yīng)，使之成為具有可見(jiàn)光、紫外生色團(tuán)或者能產(chǎn)生熒光的衍生物，才能進(jìn)行檢測(cè)。

圖1 氨基酸結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure of amino acids

根據(jù)衍生化反應(yīng)時(shí)間，衍生法可分為柱前衍生和柱后衍生。采用柱后衍生的有離子交換色譜法等。采用柱前衍生的有高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法、氣相色譜法等。在茶葉中應(yīng)用較多的氨基酸衍生化分析技術(shù)法主要有以下幾種。

2.1.1 柱后衍生離子交換色譜法

氨基酸在酸性條件下會(huì)形成陽(yáng)離子并且被離子交換柱吸附，由于各氨基酸所帶電荷、等電點(diǎn)、分子大小等的不同，各氨基酸的被流動(dòng)相洗脫的順序也不同，其中堿性氨基酸的吸附程度最強(qiáng)，其次為中性氨基酸，酸性氨基酸吸附力最弱。柱后衍生離子交換色譜法就是利用離子交換柱對(duì)各氨基酸吸附能力的不同對(duì)氨基酸進(jìn)行分離純化，分離后的氨基酸可與衍生劑發(fā)生反應(yīng) （茚三酮是最常用的柱后衍生化試劑），再用紫外-可見(jiàn)光度檢測(cè)器檢測(cè)。在1958年MOORE等[11]應(yīng)用此原理首次實(shí)現(xiàn)了氨基酸自動(dòng)化測(cè)定，氨基酸自動(dòng)分析儀也隨之問(wèn)世。

氨基酸自動(dòng)分析儀是專門檢測(cè)氨基酸的儀器，氨基酸在陽(yáng)離子交換樹(shù)脂上被吸附后，通過(guò)氨基酸自動(dòng)分析儀設(shè)定的洗脫程序，用不同離子強(qiáng)度、pH值的緩沖液依次將不同吸附程度的氨基酸洗脫下來(lái)。被洗脫下來(lái)的氨基酸與茚三酮溶液在加熱的條件下反應(yīng)生成紫色絡(luò)合物，可通過(guò)分光光度計(jì)在570 nm處檢測(cè)到。目前常用的分離柱主要是以磺酸型強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂為填料。該儀器具有靈敏、快速、前處理簡(jiǎn)便、分辨率高、重現(xiàn)性好、結(jié)果可靠等多項(xiàng)優(yōu)點(diǎn)，且由于陽(yáng)離子交換柱對(duì)氨基酸進(jìn)行了分離純化，避免了其他物質(zhì)對(duì)氨基酸衍生化的干擾，適用于大量樣品的分析。在GB 5009.124—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測(cè)定》中應(yīng)用的正是此法[12]。經(jīng)過(guò)多年的發(fā)展，氨基酸自動(dòng)分析儀已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了參數(shù)控制、數(shù)據(jù)采集、積分處理和報(bào)告結(jié)果的全部自動(dòng)化電腦化。目前，該儀器廣泛應(yīng)用于飼料[13]、食品[14-15]、煙草[16]等行業(yè)，在茶葉氨基酸組分檢測(cè)應(yīng)用中也較為常見(jiàn)，已有多種茶類氨基酸組分檢測(cè)應(yīng)用的報(bào)道[17-21]。

盡管氨基酸自動(dòng)分析儀法現(xiàn)已較為成熟地應(yīng)用，但還存在著一些問(wèn)題：（1）受儀器型號(hào)及實(shí)驗(yàn)條件影響較明顯。相比較于其它液相色譜類儀器，氨基酸自動(dòng)分析儀不僅受離子交換樹(shù)脂的型號(hào)、交聯(lián)度和粒度的影響，還受柱溫、洗脫緩沖的陽(yáng)離子類型、pH值、離子強(qiáng)度、淋洗梯度、流速以及其中有機(jī)溶劑含量的影響，因此不同氨基酸自動(dòng)分析儀和不同實(shí)驗(yàn)室之間所得到的氨基酸圖譜可能會(huì)有差別，所以要用好氨基酸自動(dòng)分析儀，還需要對(duì)緩沖液配方和分析程序設(shè)置進(jìn)行調(diào)節(jié)[22-23]；（2）靈敏度不高，只可對(duì)100 pmol以上的氨基酸進(jìn)行檢測(cè)[24]；（3）需要雙波長(zhǎng)檢測(cè)。脯氨酸的測(cè)定波長(zhǎng)為440 nm，其它氨基酸的測(cè)定波長(zhǎng)為570 nm。

2.1.2 柱前衍生高效液相色譜法

高效液相色譜（HPLC）具有高效、靈敏、準(zhǔn)確和適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，將其與化學(xué)衍生法結(jié)合已成為氨基酸分離和分析的重要手段，并已經(jīng)在食品領(lǐng)域氨基酸的測(cè)定中得到較廣泛的應(yīng)用[25-29]。其中柱前衍生高效液相色譜法的原理是先用衍生試劑將氨基酸轉(zhuǎn)化為具有可見(jiàn)光、紫外生色團(tuán)或者能產(chǎn)生熒光的衍生物，再通過(guò)紫外、熒光等檢測(cè)器測(cè)定氨基酸含量。柱前衍生反相高效液相色譜是鍵合反相高效液相色譜（RPLC）和柱前衍生技術(shù)的結(jié)合。這兩種方法的關(guān)鍵都在于衍生劑的選擇。氨基酸與不同的衍生劑反應(yīng)，要求的衍生方法會(huì)有差異，也會(huì)產(chǎn)生不同的衍生物，導(dǎo)致其所需的色譜條件及要求的檢測(cè)器也會(huì)有差異。一般對(duì)于衍生劑的選擇標(biāo)準(zhǔn)是要能與各級(jí)氨基酸定量反應(yīng)，且各氨基酸產(chǎn)物單一、穩(wěn)定，干擾物少。

目前常用的衍生劑有鄰苯二甲醛（OPA）、2，4-二硝基氟苯 （FDBN）、9-芴甲基氯甲酸酯（FMOC-Cl）、異硫氰酸苯酯 （PITC）和丹酰氯（DNS-Cl）等，其優(yōu)缺點(diǎn)比較見(jiàn)表 1。

表1 柱前衍生液相色譜法分析氨基酸的常用衍生試劑優(yōu)缺點(diǎn)比較Table 1 Comparion of pre-column derivatization reagent used for amino acids analysis by HPLC

柱前衍生-HPLC法測(cè)定茶葉氨基酸組分具有高效快速、結(jié)果準(zhǔn)確、成本低廉等許多優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用也越來(lái)越多。各種衍生劑有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，在應(yīng)用柱前衍生-HPLC法測(cè)定茶葉氨基酸組分時(shí)，應(yīng)根據(jù)儀器、試劑條件作出適宜的選擇，選擇時(shí)盡量以衍生產(chǎn)物穩(wěn)定、靈敏度高、重現(xiàn)性好、操作簡(jiǎn)便為標(biāo)準(zhǔn)。

2.1.3 AccQ·Tag法

AccQ·Tag法是Waters公司1994年開(kāi)發(fā)的專門用于肽及蛋白質(zhì)水解氨基酸分析的柱前衍生技術(shù)。其基本操作是通過(guò)用Waters的AccQ·FluorTM衍生試劑（AQC）衍生氨基酸后，用HPLC分離衍生產(chǎn)物，并用熒光或紫外檢測(cè)器定量檢測(cè)衍生產(chǎn)物。此方法的關(guān)鍵在于衍生試劑AQC，這是一款專為氨基酸分析而開(kāi)發(fā)的含N-羥基琥珀酰亞氨基的活性雜環(huán)氨基甲酸酯，能與所有含氨基的化合物發(fā)生快速、定量反應(yīng)，而且過(guò)量的AQC可在1 min內(nèi)水解為6-氨基喹啉（AMQ），AMQ的熒光吸收波長(zhǎng)與氨基酸的衍生物吸收波長(zhǎng)不同，不會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。

朱旗等[36]嘗試了將此法應(yīng)用于茶葉氨基酸的測(cè)定。應(yīng)用Waters 600高效液相色譜系統(tǒng)、AccQ·Tag及Waters 470熒光檢測(cè)器對(duì)綠茶和速溶綠茶中游離氨基酸組分進(jìn)行了定性和定量分析。測(cè)定圖譜表明，該方法可以較好的分離氨基酸組分，鑒定出16種氨基酸，但未能檢出甘氨酸和半胱氨酸。與氨基酸自動(dòng)分析儀結(jié)果比較，AccQ·Tag法含量較高的五種氨基酸為茶-甲硫-谷-天-絲，而氨基酸自動(dòng)分析儀的檢測(cè)結(jié)果為茶-谷-天-精-絲。甲硫氨酸和精氨酸的含量高低順序不同，這種現(xiàn)象出現(xiàn)的原因未明，還待研究。

該法衍生操作方便，反應(yīng)產(chǎn)物在熒光和紫外下都有很強(qiáng)的吸收，常見(jiàn)的鹽和洗滌劑不影響衍生，生成的衍生物穩(wěn)定，已在多個(gè)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。其缺點(diǎn)是衍生劑較貴，并且為使酪氨酸衍生反應(yīng)完全，需在55℃加熱10 min。

2.1.4 毛細(xì)管電泳法

毛細(xì)管電泳法（CE）是一種20世紀(jì)80年代發(fā)展起來(lái)的，以高壓電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，以毛細(xì)管為分離通道的高效分離技術(shù)。在電場(chǎng)作用下，帶電粒子以不同的遷移速度在毛細(xì)管內(nèi)的電解質(zhì)溶液中進(jìn)行遷移，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后，樣品各組分按其速度大小順序，依次到達(dá)檢測(cè)器，獲得的電泳譜圖用可于樣品組分的定量或定性分析[37]。與色譜法相比，CE法具有高效、快速、樣品耗量少、靈敏度高、抗污染能力強(qiáng)、對(duì)樣品預(yù)處理要求低等優(yōu)點(diǎn)[38]。但同時(shí)，CE法也存在著檢出限、重現(xiàn)性較差的問(wèn)題，以及電解質(zhì)遷移率方面還存在著一些不足等問(wèn)題。因此，研究者們開(kāi)始探索CE法與其它儀器的聯(lián)合。用于CE法的檢測(cè)方式主要有紫外吸收檢測(cè)法（UV）、激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)法（LIF）和質(zhì)譜檢測(cè)法（MS）[39]。UV法是應(yīng)用最廣泛的檢測(cè)方式。LIF法具有較高的檢測(cè)靈敏度，應(yīng)用也越來(lái)越多。CEMS法是分析氨基酸的一種新的發(fā)展方向，因?yàn)橘|(zhì)譜作為檢測(cè)器，除了具有高的靈敏度和較強(qiáng)的定性功能外，還可以提供樣品的結(jié)構(gòu)信息[40]。

目前CE法與其它儀器聯(lián)合檢測(cè)茶葉中游離氨基酸已有研究者在探索。MING等[41]通過(guò)CE和LED -IF （Light-emitting diode -induced fluorescence）聯(lián)用，采用萘-2，3-二甲醇（NDA）為衍生劑，檢測(cè)出了茶葉和茶飲料中的包括茶氨酸、γ-氨基丁酸在內(nèi)的17種游離氨基酸，RSD小于2.7%，檢測(cè)限為3.6～28.3 nM。近幾年，不需經(jīng)過(guò)衍生劑衍生的CE法在茶葉氨基酸檢測(cè)中的應(yīng)用也已在探索。MOHAMED等[42]建立了一種CE和ELSD（蒸發(fā)光散射檢測(cè)器）耦聯(lián)，通過(guò)碳納米管，不需經(jīng)過(guò)衍生就可檢測(cè)茶葉中氨基酸的方法，應(yīng)用此法，分離出了白茶樣品中的7種游離氨基酸。如需成熟應(yīng)用此法檢測(cè)茶葉中的游離氨基酸，還需更進(jìn)一步的研究。

2.1.5 氣相色譜法

氣相色譜法（GC）的原理是待測(cè)樣氣化后由氣體流動(dòng)相攜帶通過(guò)色譜柱時(shí)，因與固定相的結(jié)合能力不同，會(huì)形成差速遷移，從而實(shí)現(xiàn)不同組分的分離，將流出的各組分經(jīng)過(guò)檢測(cè)器分析，可轉(zhuǎn)變成可測(cè)定的電信號(hào)，并放大傳遞給處理系統(tǒng)，進(jìn)行定性、定量分析。由于氨基酸含有氨基、羧基和羥基等極性基團(tuán)，應(yīng)用GC法檢測(cè)氨基酸時(shí)需選擇適合的衍生劑，將氨基酸衍生為易于氣化的衍生物，然后選擇合適的固定相和檢測(cè)器進(jìn)行分離。

目前常用的衍生劑有三氟乙酰（TFA）、五氟丙酰（PFP）、正丙醇、七氟丙酰（HFB）和異丙醇等。氣相色譜法的優(yōu)點(diǎn)是分離時(shí)間短、柱效高。缺點(diǎn)是衍生條件苛刻，不能采用同一根色譜柱實(shí)現(xiàn)全部氨基酸的測(cè)定，操作繁瑣、衍生反應(yīng)干擾多、專一性差?；诖?，單獨(dú)的GC法在氨基酸的分析中應(yīng)用并不多。但GC易與質(zhì)譜（MS）聯(lián)用，經(jīng)過(guò)GC分離的各氣態(tài)分子受離子源轟擊，電離裂解成分子，并進(jìn)一步碎裂為碎片離子。該碎片離子在電場(chǎng)和磁場(chǎng)綜合作用下，按照大小進(jìn)行分離，到達(dá)檢測(cè)器檢測(cè)、記錄和整理，獲得質(zhì)譜圖，從而實(shí)現(xiàn)樣品的定性定量分析。相對(duì)于GC，GC-MS可以明顯提高對(duì)樣品的檢測(cè)限和靈敏度。目前，GC-MS法在植物、食品、藥品等多個(gè)領(lǐng)域[43-45]氨基酸分析檢測(cè)中都有大量的應(yīng)用報(bào)道。

張佳等[46]以正纈氨酸作為內(nèi)標(biāo)，N-（特丁基二甲基硅烷）-N-甲基三氟乙酰胺（MTBSTFA）作為衍生劑，應(yīng)用GC-MS法定量檢測(cè)了茶葉中包含茶氨酸在內(nèi)的15種氨基酸。將其中7種氨基酸的檢測(cè)結(jié)果與氨基酸自動(dòng)分析儀比對(duì)，略有差異，趨勢(shì)一致，但在檢測(cè)過(guò)程中，茶氨酸會(huì)產(chǎn)生3個(gè)衍生峰，只能進(jìn)行推斷性判斷。GC-MS是一種簡(jiǎn)單有效的定性、定量方法，但應(yīng)用此法測(cè)定茶葉中游離氨基酸的研究報(bào)道還不常見(jiàn)，還需要對(duì)衍生條件及衍生產(chǎn)物的特性進(jìn)行進(jìn)一步的摸索。

2.2 茶葉中氨基酸非衍生化分析技術(shù)法

由于氨基酸衍生化反應(yīng)存在著操作步驟繁瑣，衍生產(chǎn)物不穩(wěn)定，運(yùn)行時(shí)間較久（一般分析時(shí)間常見(jiàn)的為30～90 min）等問(wèn)題，研究者們嘗試著利用LC結(jié)合MS或蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）來(lái)直接分離檢測(cè)游離氨基酸組分。

2.2.1 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

質(zhì)譜是一種測(cè)定各種物質(zhì)的原子、分子質(zhì)量的分析方法。其基本原理是將樣品中的目標(biāo)物離子化形成帶電荷的離子后，根據(jù)質(zhì)荷比（m/z）分離進(jìn)行質(zhì)量分析，經(jīng)檢測(cè)器檢測(cè)離子后，可通過(guò)數(shù)據(jù)分析獲得相應(yīng)的質(zhì)譜圖。質(zhì)譜與色譜系統(tǒng)聯(lián)用（LC-MS），在目標(biāo)物經(jīng)質(zhì)譜離子化后，利用各離子在液相的固定相和流動(dòng)相中的作用力和洗脫速度的不同，達(dá)到分離的目的，可對(duì)單個(gè)或混合物進(jìn)行定性定量分析。LC-MS結(jié)合了液相色譜的強(qiáng)大分離功能，對(duì)極性化合物分析無(wú)需衍生化；結(jié)合了質(zhì)譜分析的高選擇性、高特異性、高靈敏度、高穩(wěn)定性；樣品處理簡(jiǎn)單，分析通量高，易于自動(dòng)化；分析復(fù)雜樣品時(shí)干擾小，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確度高，可信度高，特別適合于低含量樣品的檢測(cè)分析，已成為分析氨基酸的一種新趨勢(shì)。

LC與MS聯(lián)用技術(shù)最重要的是電離接口位置，目前大氣壓電離接口（API）是現(xiàn)有商品化儀器中最為普遍的電離接口，大部分API擁有電噴霧電離（ESI）和大氣壓化學(xué)電離（APCI）兩種接口技術(shù)，其中ESI常用于分析極性較強(qiáng)的化合物。近年來(lái)，隨著串聯(lián)質(zhì)譜（MS-MS）和電噴霧離子源（ESI）的快速發(fā)展，使得LC-MS-MS法成為了氨基酸檢測(cè)的最熱門分析手段之一。串聯(lián)質(zhì)譜可以設(shè)定一定的質(zhì)荷比值，來(lái)限制分離分析的范圍，具有特征離子提取功能，即便在LC中未被完全分離的物質(zhì)，通過(guò)MS的特征離子的質(zhì)量色譜圖也可以對(duì)不同的物質(zhì)進(jìn)行各自的定性定量分析，定性能力強(qiáng)，因此無(wú)需對(duì)樣品進(jìn)行衍生處理。與LC和GCMS相比，樣品前處理過(guò)程簡(jiǎn)單化，對(duì)于樣品的分離度要求也相對(duì)較低。目前此方法在測(cè)定植物領(lǐng)域包括煙草[47-48]、天南星[49]及動(dòng)物體內(nèi)[50]的游離氨基酸已見(jiàn)較多應(yīng)用。在用此法分析煙草中的游離氨基酸時(shí)，煙草樣品經(jīng)萃取過(guò)濾后可直接進(jìn)樣，其結(jié)果線性相關(guān)系數(shù)達(dá)0.997以上，可分析煙草中18～20種氨基酸[46-47]。還未見(jiàn)應(yīng)用此法測(cè)定茶葉中游離氨基酸的研究報(bào)道。

根據(jù)其它植物領(lǐng)域中應(yīng)用LC-MS-MS法檢測(cè)游離氨基酸的情況，歸納出幾點(diǎn)參考建議：一是由于部分游離氨基酸組分極性較大，一般而言，在建立LC-MS-MS方法檢測(cè)氨基酸時(shí)，流動(dòng)相最好加緩沖鹽，可起到增強(qiáng)離子化和霧化的作用，銨鹽和鈉鹽是常用的兩種緩沖鹽。在測(cè)定茶葉中游離氨基酸時(shí)，乙酸銨是一個(gè)不錯(cuò)的選擇；二是在質(zhì)譜的離子化模式選擇時(shí)，考慮到氨基酸組分的等電點(diǎn)，如果選取的流動(dòng)相pH在等電點(diǎn)之下，可以用正模式離子化方式；三是在進(jìn)行標(biāo)樣優(yōu)化時(shí)，要注意濃度選取。如果濃度太低，不能得到較好的信號(hào)，濃度太高容易形成二聚體甚至多聚體，難以判斷信號(hào)峰。一般可以用1 ppm的標(biāo)樣濃度進(jìn)行優(yōu)化。

2.2.2 液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器法

蒸發(fā)光散射檢測(cè)器法（ELSD）是將柱洗脫液進(jìn)行噴霧霧化形成氣溶膠，然后在加熱的漂移管中將流動(dòng)相溶劑蒸發(fā)，再將留下的不揮發(fā)成分用光照射，通過(guò)檢測(cè)它的散色光來(lái)進(jìn)行測(cè)定的一種方法。與流動(dòng)相在一起但未蒸發(fā)的物質(zhì)基本上都可檢測(cè)，不依賴于樣品分子中的官能團(tuán)。ELSD法靈敏度高，無(wú)溶劑的干擾和因溫度變化引起的基線漂移，適用于梯度洗脫，適合與LC聯(lián)用。

李銀花等[51]應(yīng)用ELSD-2000檢測(cè)了綠茶中的茶氨酸。檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，茶氨酸峰面積與進(jìn)樣量呈非線性關(guān)系，需通過(guò)雙對(duì)數(shù)坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為log（峰面積）=1.532401+5.329247×log（進(jìn)樣量，μg），此線性回歸相關(guān)系數(shù)可達(dá)0.9997，加標(biāo)回收率為96.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.92%。最低檢測(cè)限為0.012 mg/mL。

2.2.3 陰離子交換色譜-積分脈沖安培法

安培檢測(cè)屬于電化學(xué)檢測(cè)技術(shù)范疇，是用于測(cè)量電活性物質(zhì)在工作電極表面發(fā)生氧化或還原反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生電流變化的檢測(cè)器。在pH 12～13溶液中，如在金工作電極和參比電極之間施加一個(gè)較高的電位，氨基酸在金工作電極表面被氧化為亞胺，其中絕大部分亞胺進(jìn)一步氧化為腈基化合物，少量亞胺水解生成醛類化合物。積分脈沖安培檢測(cè)（IPAD）就是通過(guò)在每次脈沖前對(duì)工作電極上施加循環(huán)方波或三角波電位下產(chǎn)生電流積分，積分整個(gè)高-低采樣電位下的電流所得到的信號(hào)就是被分析物產(chǎn)生的信號(hào)[52]。此法通過(guò)與陰離子交換色譜（HPAEC）結(jié)合，使氨基酸分子中的羧基在強(qiáng)堿性流動(dòng)液中形成陰離子，被陰離子交換樹(shù)脂保留，而其中的氨基在強(qiáng)堿性介質(zhì)中通過(guò)IPAD法進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)氨基酸的定性、定量分析。HPAEC-IPAD法可以對(duì)氨基酸直接進(jìn)行分析，無(wú)需柱前或柱后衍生，對(duì)氨基酸的檢出限為pmolfmol級(jí)。

該法目前已用于檢測(cè)植物和食品[53-55]中的游離氨基酸，未見(jiàn)在茶葉游離氨基酸檢測(cè)中有應(yīng)用。從在其它植物游離氨基酸檢測(cè)的結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用HPAEC-IPAD法檢測(cè)各氨基酸組分的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)一般可達(dá)0.9900以上，加標(biāo)回收率在80%～115%之間。在用HPAEC-IPAD法檢測(cè)樣品中的游離氨基酸時(shí)，需注意樣品中的含糖化合物對(duì)測(cè)定結(jié)果的干擾。

3 展望

氨基酸是茶葉中的重要品質(zhì)成分，對(duì)茶葉中游離氨基酸檢測(cè)方法也一直在摸索與精進(jìn)中。氨基酸自動(dòng)分析儀法應(yīng)用于茶葉中氨基酸的檢測(cè)已有多年的歷史，但存在著設(shè)備價(jià)格及儀器局限性等問(wèn)題。經(jīng)過(guò)多年發(fā)展，柱前衍生-HPLC測(cè)定技術(shù)已經(jīng)取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，其測(cè)定精密度和準(zhǔn)確性正向離子交換法逼近，加之HPLC在靈敏度、儀器普及面廣、能一機(jī)多用等方面的優(yōu)勢(shì)，HPLC測(cè)定氨基酸正式進(jìn)入廣泛應(yīng)用階段，但高效液相色譜法的衍生化精確性及操作性等問(wèn)題還有待更完善的解決。對(duì)于基質(zhì)復(fù)雜、鹽等干擾因子較多的樣品，至今離子交換法仍被認(rèn)為是最經(jīng)典的測(cè)定方法。在已有方法進(jìn)步優(yōu)化的同時(shí)，新的檢測(cè)手段如GC-MS、LC-MS-MS等方法也正在悄然興起，更準(zhǔn)確、高效、快速、操作簡(jiǎn)便是茶葉氨基酸檢測(cè)方法的未來(lái)趨勢(shì)及目標(biāo)。