安曉穎 楊永輝 朱桂云 方鵬 白洪忠 章志華

結核性胸膜炎目前常用的檢測方法主要包括胸膜活檢、胸腔積液檢測、胸部CT掃描等[1-3]，但其檢查陽性率低、培養(yǎng)周期長且活檢創(chuàng)傷性較大，容易導致漏診及誤診。近年來結核性胸膜炎發(fā)病過程、發(fā)病機制的研究越來越深入，以γ-干擾素(IFN-γ)為主的輔助性T細胞1(Th1)型免疫應答在結核性胸膜炎的發(fā)病機制中起重要作用，一些基于細胞免疫反應的檢測方法為結核性胸膜炎的診斷開辟了新的途徑[4-5]。

細胞免疫是機體抗結核感染的主要途徑，結核分枝桿菌分泌蛋白可誘導細胞免疫應答，其中分泌蛋白抗原85B(Ag85B)-早期分泌靶抗原6(ESAT6)是MTB生長過程中的主要分泌蛋白，具有高度的保護性免疫能力[6-8]。它可激活CD4+T 淋巴細胞(簡稱“CD4+細胞”)，并促使Th1增殖，誘導產生IFN-γ，促進抗體產生和增強巨噬細胞吞噬消化MTB的能力。因此，筆者采用MTB Ag85B-ESAT6融合蛋白對不同組別患者胸腔積液和外周血細胞成分進行刺激，通過流式細胞檢測上述融合蛋白刺激后T淋巴細胞分泌抗原特異性IFN-γ的水平，以評價此種方法在結核性胸膜炎中的診斷價值。

資料和方法

一、資料

1．研究對象：所選患者均為2014年1月至2015年1月河北省胸科醫(yī)院住院患者。本次研究入選結核性胸膜炎患者45例，男31例，女14例，年齡20～45歲，平均(35.13±6.77)歲；非結核性胸膜炎患者26例，男14例，女12例，年齡20～45歲，平均(33.46±7.56)歲。健康體檢者25名，體檢各項指標均在正常范圍內，其中男14名，女11名，年齡20～45歲，平均(33.96±7.81)歲。研究對象性別、年齡差異均無統(tǒng)計學意義(表1)。

2．納入標準：(1)所有研究對象均無心、肝、腎等臟器并發(fā)癥及其他感染，無糖尿病、自身免疫相關性或免疫性疾病，3個月內無重大手術及外傷史，未用過免疫抑制劑及糖皮質激素等藥物，未行胸膜腔內藥物治療；(2)結核性胸膜炎患者診斷標準參照《臨床診療指南·結核病分冊》[9]，符合以下條件：①胸膜活檢提示抗酸染色陽性的肉芽腫性病變；②胸腔積液或胸膜活檢涂片及結核分枝桿菌培養(yǎng)陽性，或TB-DNA檢測陽性；③胸膜活檢提示肉芽腫性病變，抗酸染色涂片陰性，但臨床及影像學檢查支持結核，且抗結核藥物治療有效；(3)非結核性胸膜炎患者納入標準，臨床診斷不是由結核分枝桿菌感染所引發(fā)的類肺炎性胸腔積液和惡性胸腔積液患者；(4)健康人群均為至我院體檢中心進行常規(guī)體檢者，符合納入標準(1)且無納入標準(2)和納入標準(3)情況的體檢人員。所有研究對象在采集標本前均告知并征得本人同意并簽署知情同意書。研究方案取得本院倫理委員會批準。

表1 不同組別研究對象的性別和年齡比較

注a：結核組與非結核組比較；b：非結核性組與健康組比較；c：結核組與健康組比較

二、方法

1．標準品準備：IFN-γ標準品為凍干粉(購自北京曠博生物技術有限公司)，使用前2000×g離心10 s，加入250 μl 稀釋緩沖液，混勻冰浴5 min，取一支八連排管，標記1～8，每管加入120 μl 稀釋緩沖液，取60 μl標準品原液加入1號管，混勻，由1號管依次轉移60 μl到下一管混勻至7號管，8號管為本底，完成梯度稀釋(3倍稀釋)。

2．標本采集及處理：所有研究對象，使用肝素和乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝管分別采集外周血4～6 ml；結核性胸膜炎患者和非結核性胸膜炎患者接受規(guī)范的胸腔穿刺抽液術，收集新鮮胸腔積液50 ml，2 h內送檢；結核性胸膜炎患者和非結核性胸膜炎患者的活檢組織標本經(jīng)手術或細針穿刺獲得，使用4%甲醛固定24 h，常規(guī)病理取材、包埋、制片。

3．外周血和胸腔積液中IFN-γ水平測定：收集的外周血和胸腔積液在30 min內，1000×g離心10 min，取上清，根據(jù)Aimplex?Human custom 5-plex kit(貨號T1C052806，購自北京曠博生物技術有限公司)說明書，使用流式細胞儀[型號NovoCyte D1040，購自艾森生物(杭州)有限公司]測定IFN-γ的含量。

4． MTB Ag85B-ESAT6融合蛋白刺激外周血和胸腔積液細胞產生IFN-γ水平的測定：使用淋巴細胞密度分離液，分離外周血和胸腔積液中單個核細胞(PBMCs)。將得到的細胞使用MD-AIM-V細胞培養(yǎng)基進行重懸，計數(shù)板計數(shù)，稀釋至2×105個細胞/ml，取200 μl于96孔細胞培養(yǎng)板，并加入MTB Ag85B-ESAT6融合蛋白(Ag85B-ESAT6融合蛋白終濃度為1 mg/L)[10]。將培養(yǎng)板置于37 ℃、CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，孵育16～18 h 后收集細胞培養(yǎng)液上清，采用流式細胞儀，根據(jù)Aimplex?Human custom 5-plex kit說明書，測定IFN-γ水平。

5．免疫組織化學染色(IHC染色)檢測：活檢組織標本石蠟切片經(jīng)脫蠟、水化、抗原修復和內源過氧化物酶清除等步驟后，流水沖洗干凈待用；除去切片上的水分，在離活檢病灶組織3 mm處用IHC油筆(PEN-0002，邁新)畫圈，加CD4(ab133616，abcam)和CD8(ab85792，abcam)一抗室溫孵育1 h，PBS沖洗3次；加二抗孵育30 min，PBS沖洗3次；DAB顯色5 min，蒸餾水沖洗3次，蘇木精染色，吹干封片，鏡下觀察拍照，采用Image-Pro plus軟件檢測，以積累光密度值(IOD值)均值表示并進行統(tǒng)計學分析。

三、統(tǒng)計學處理

結 果

一、MTB Ag85B-ESAT6融合蛋白刺激前血清和胸腔積液中IFN-γ水平比較

在未使用MTB Ag85B-ESAT6融合蛋白刺激前，結核組與非結核組血清中IFN-γ的含量比較，差異無統(tǒng)計學意義(t=1.747，P=0.085)；結核組與健康組比較，差異無統(tǒng)計學意義(t=1.412，P=0.163)；非結核組與健康組血清中IFN-γ的含量比較，差異無統(tǒng)計學意義(t=-0.317，P=0.752)(表2)。

在MTB Ag85B-ESAT6融合蛋白刺激前，非結核組患者胸腔積液中IFN-γ含量為(47.99±11.49) pg/ml，結核組患者胸腔積液中IFN-γ含量為(411.91±41.56) pg/ml，結核組患者IFN-γ含量高于非結核性胸膜炎組，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(t=55.194，P<0.001)(表3)。

二、MTB Ag85B-ESAT6融合蛋白刺激后外周血和胸腔積液中單個核細胞產生IFN-γ水平的比較

結核組、非結核組和健康組研究對象外周血中單個核細胞經(jīng)過MTB Ag85B-ESAT-6融合蛋白刺激后， IFN-γ含量分別為(401.90±72.54) pg/ml，(40.04±6.80) pg/ml和(39.86±6.97) pg/ml，結核組與非結核組、健康組比較差異均有統(tǒng)計學意義(t值分別為33.211、33.204，P值均<0.05)。非結核組與健康組比較，差異無統(tǒng)計學意義(t=0.094，P=0.925)(表4)。

表2 不同組別MTB Ag85B-ESAT6融合蛋白刺激前血清中IFN-γ含量比較

注a：結核組與非結核組比較；b：非結核性組與健康組比較；c：結核組與健康組比較

表3 結核與非結核組胸腔積液行MTB Ag85B-ESAT6融合蛋白刺激前后的IFN-γ含量比較

注刺激前結核組與非結核組比較(t=55.194，P=0.000)，刺激后結核組與非結核組比較(t=51.478，P=0.000)，刺激后結核性胸膜組與刺激前非結核組比較(t=51.499，P=0.000)

表4 不同組別MTB Ag85B-ESAT6融合蛋白刺激外周血中單個核細胞產生IFN-γ含量比較

注a：結核組與非結核組比較；b：非結核組與健康組比較；c：結核組與健康組比較

結核組和非結核組患者胸腔積液中單個核細胞經(jīng)過MTB Ag85B-ESAT6融合蛋白刺激后，結核組患者的IFN-γ含量為(1342.67±167.96) pg/ml，非結核組患者的IFN-γ含量為(48.76±11.25) pg/ml，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(t=51.478，P=0.000)(表3)。

三、MTB Ag85B-ESAT6融合蛋白刺激前后外周血和胸腔積液中IFN-γ水平的比較

結核組外周血中單個核細胞經(jīng)MTB Ag85B-ESAT6融合蛋白刺激后與刺激前血清中IFN-γ的含量比較，差異有統(tǒng)計學意義(t=32.879，P<0.001)。非結核組和健康組患者外周血刺激前后IFN-γ的含量比較，差異均無統(tǒng)計學意義(t值分別為0.554、0.122，P值均>0.05)(表5)。

結核組患者胸腔積液中單個核細胞經(jīng)MTB Ag85B-ESAT6融合蛋白刺激后較刺激前胸腔積液中IFN-γ含量升高，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(t=36.085，P=0.000)。結核組患者胸腔積液刺激后較非結核組患者刺激前IFN-γ的含量比較，差異具有統(tǒng)計學意義(t=51.499，P<0.001)。非結核組患者胸腔積液刺激前后比較，差異無統(tǒng)計學意義(t=0.244，P=0.808)(表3)。

四、IHC染色檢測結果

采用IHC染色的方法檢測結核與非結核組患者組織標本中CD4+和CD8+細胞的分布情況(圖1～4)，檢測結果顯示，結核性胸膜炎患者組織標本中CD4+和CD8+細胞的IOD值分別為(16 349.91±2376.36)和(10 525.77±1164.86)，非結核組患者組織標本中CD4+和CD8+細胞的IOD值分別為(1853.64±670.40)和(1327.15±175.55)；結核組患者的CD4+和CD8+細胞量與非結核組比較顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義(t值分別為14.381、19.127，P值均為0.000)。

表5 不同組別MTB Ag85B-ESAT6融合蛋白刺激前后外周血中IFN-γ含量的比較

圖1 非結核組CD4+細胞染色(IHC染色 × 4) 圖2 結核組CD4+細胞染色(IHC染色 × 20) 圖3 非結核組CD8+細胞染色(IHC染色 × 4) 圖4 結核組患者CD8+細胞染色(IHC染色 × 20)

討 論

結核性胸膜炎是胸腔積液的常見原因，發(fā)生于胸膜腔局部。主要臨床表現(xiàn)為胸膜充血、血管通透性改變、中性粒細胞浸潤，隨著病情進展胸膜表面有纖維素性滲出，繼而出現(xiàn)漿液滲出。傳統(tǒng)的檢測方法包括胸膜活檢、胸腔積液檢驗、胸部 CT掃描等，由于創(chuàng)傷性大或檢測陽性率低等因素為結核性胸膜炎的診斷及治療帶來挑戰(zhàn)。隨著免疫學檢測技術的進展，一些基于細胞免疫反應的檢測方法已經(jīng)用于臨床檢測[11]。

結核分枝桿菌抗原特異性IFN-γ作為抗結核感染免疫反應的關鍵性細胞因子，通過體外測定其表達水平能夠有效判定機體結核分枝桿菌感染情況。目前，對于胸腔積液γ干擾素釋放試驗(IGRA)的臨床應用研究比較廣泛，Ates等[12]發(fā)現(xiàn)胸腔積液標本采用QuantiFERON-TB Gold In-Tube (QFT-GIT) 技術檢測結核性胸膜炎的準確性較差。筆者采用流式細胞儀檢測結核性胸膜炎患者和非結核胸膜炎患者外周血和胸腔積液標本中IFN-γ的含量及健康人外周血中IFN-γ的含量，結果顯示，結核組、非結核組及健康組血清中IFN-γ的含量比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但結核性胸膜炎患者組胸腔積液中IFN-γ的含量要顯著高于非結核性胸膜炎患者組(P<0.05)，與Liu等[13]的研究結果一致，表明胸腔積液IGRA檢測特異度高于外周血。同時免疫組織化學染色顯示，結核組病灶組織中CD4+和CD8+細胞的表達要顯著高于非結核組，表明CD4+細胞在結核病的免疫保護機制中發(fā)揮著重要的作用，而且這些免疫細胞還可刺激 CD8+細胞產生免疫反應并促進體液免疫反應的發(fā)生[14-15]。

結核分枝桿菌強免疫原性Ag85復合物抗原是結核分枝桿菌中早期的主要分泌性蛋白質，含量十分豐富，其中，Ag85B不但參與分枝菌酸的合成，影響細菌細胞壁的最終裝配，參與補體受體介導的結核分枝桿菌吞噬作用，對結核分枝桿菌在宿主體內的行為有重要影響[16]。ESAT6由RD1(region of difference 1)基因區(qū)域編碼，是結核分枝桿菌在感染早期的分泌性蛋白質，具有免疫保護力。該抗原可被感染了結核分枝桿菌的動物或患者有免疫活性的T淋巴細胞所識別，并產生高水平的IFN-γ；同時也具有刺激B淋巴細胞反應的抗原決定簇[17]。何宗林和杜先智[18]研究顯示，Ag85B-ESAT6融合蛋白可誘導長期抗結核免疫記憶，并產生強烈的免疫應答。筆者采用Ag85B-ESAT6融合蛋白[19-20]對不同患者來源的胸腔積液及外周血樣本中分離的細胞成分進行刺激，顯示結核組刺激前后外周血和胸腔積液中IFN-γ含量差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而非結核組和健康組在刺激前后的IFN-γ含量差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)，提示結核性胸膜炎患者的胸腔積液和外周血中單個核細胞經(jīng)Ag85B-ESAT6融合蛋白刺激后能誘導產生高水平的IFN-γ，該方法對結核性胸膜炎的輔助診斷有很高的價值[21]。

綜上所述，Ag85B-ESAT6融合蛋白刺激后能顯著提高結核分枝桿菌抗原特異性IFN-γ的含量，對于結核性胸膜炎的輔助診斷有較高的臨床應用價值。