孫聰聰，鄭加永，汪文寰，胡艷君，鄭建瓊，張紅萍

（1.溫州市人民醫(yī)院 溫州市婦幼保健院 婦產科，浙江 溫州 325000；2.溫州市婦產科學重點實驗室，浙江 溫州 325000）

Nrf2（nuclear factor elytroid-derived factor 2-related factor）是細胞氧化應激反應中的關鍵因子，調節(jié)細胞防御反應。在應激情況下，Nrf2與Keap1解離轉移至細胞核中，與核內的抗氧化反應元件相結合，啟動下游的細胞保護性分子的表達，以維持內環(huán)境的穩(wěn)定。妊娠期糖尿?。╣estational diabetes mellitus，GDM）是妊娠期間首次發(fā)現(xiàn)或發(fā)生不同程度的葡萄糖不耐受，是妊娠中晚期常見的一種并發(fā)癥，且已被明確規(guī)定為糖尿病的獨立特殊型[1-2]。而臨床糖尿病患者出現(xiàn)的氧化應激、胰島素抵抗等臨床癥狀與Nrf2的表達存在密切關系[3]，ECHOUFFO-TCHEUGUI等[4]指出，II型糖尿病患者患心臟疾病的風險較大，即II型糖尿病對不同組織的影響可能存在差異。所以，GDM為糖尿病的獨立特殊型，對母體不同的組織的影響也可能不同。我們通過構建GDM大鼠模型，檢測大鼠胎盤、子宮和心臟組織中胰島素水平、氧化應激水平[包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）水平和丙二醛（malondialdehyde，MDA）]及Nrf2蛋白的表達水平，為揭示GDM可能的發(fā)病機制及對子代產生的影響提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：清潔級雌性和雄性SD大鼠20只，體質量200～250 g，購自溫州醫(yī)科大學實驗動物中心，動物使用許可證號：SYXK（浙）2016-0287。所有雌雄大鼠均置于通風良好，相對濕度40%～70%，溫度為22～25 ℃的屏蔽系統(tǒng)內，自由飲食。給予燈光照明12 h/d，并及時更換飼料。適應性飼養(yǎng)1周后，禁食禁水12 h，快速葡萄糖氧化酶法測尾靜脈血糖，稱體質量。剔除空腹血糖≥11.1 mmol/L者。將雌雄大鼠按1∶2的比例合籠過夜，次晨發(fā)現(xiàn)陰道黏液或鏡檢有精子者記為妊娠0 d，標記孕鼠，計算孕期。

1.1.2 主要試劑：鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）購于美國Sigma公司；檸檬酸鈉購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；MDA、大鼠胰島素水平、大鼠GSH和大鼠SOD等檢測試劑盒購于上海西唐生物科技有限公司，Nrf2抗體和β-actin抗體購于美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 建立GDM大鼠模型：利用隨機數(shù)字表，將20只SD孕鼠隨機分為2組，每組10只。正常妊娠組：正常飲食。GDM組：禁食12 h，現(xiàn)配45 mg/kg STZ[5-6]，腹腔注射，4 h后正常飲食。腹腔注射STZ第5天后，尾部取血測空腹血糖，空腹血糖高于11.1 mmol/L確定為造模成功的糖尿病模型。正常妊娠組給予等量的枸櫞酸緩沖液做陰性對照。STZ溶于0.1 mol/L、pH 4.2的枸櫞酸鈉緩沖液中（現(xiàn)配現(xiàn)用，冰浴保存），按45 mg/kg濃度給予大鼠腹腔注射，每周1次。

1.2.2 提取胎盤、子宮和心臟組織蛋白：對未分娩的孕20 d大鼠禁食12 h后，腹腔注射3.5%水合氯醛進行麻醉并處死，剖腹取出胎盤、子宮和心臟組織。一份：將組織進行超聲處理，2 000 r/min離心15 min，取上清用于胰島素水平、MDA、GSH和SOD檢測。另一份：按照50 mg組織/500 μL裂解液的比例冰浴勻漿組織，裂解60 min后超聲處理溶液10 s，裂解液于4 ℃、12 000 r/min離心20 min。吸取上清，測定Nrf2的蛋白水平。

1.2.3 測定胰島素、MDA、GSH和SOD水平：按照各試劑盒說明書，采用ELISA檢測各組大鼠的胎盤、子宮和心臟組織中的胰島素、MDA、GSH和SOD水平。

1.2.4 Western blot法測定Nrf2蛋白表達：通過BCA法檢測蛋白濃度，定量蛋白濃度后，取20 μg溶解在6×loading Buffer中，加入1% SDS定容至20 μL，95 ℃煮沸5 min。蛋白上樣20 μL，9%的分離膠，5%濃縮膠電泳。濕法轉印蛋白至PVDF膜上。根據(jù)分子量大小裁膜，分別加β-actin和Nrf2一抗（稀釋濃度分別為1∶2 000）孵育，4 ℃過夜。加羊抗兔二抗（稀釋濃度為1∶3 000）孵育，常溫2 h。凝膠成像儀掃描結果后進行灰度分析。

1.3 統(tǒng)計學處理方法 采用Graphpad prism 6.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料呈正態(tài)分布，數(shù)據(jù)以表示，2組間各指標比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 2組大鼠胎盤、子宮和心臟中的胰島素水平比較 GDM組大鼠胎盤和子宮中的胰島素表達水平明顯高于正常妊娠組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而2組大鼠心臟中的胰島素水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖1。

2.2 2組大鼠胎盤、子宮和心臟中的MDA水平比較 與正常妊娠組比，GDM組大鼠的胎盤和子宮中MDA水平都有明顯的上調，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而在心臟組織中，其MDA水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖2。

圖1 2組大鼠胎盤、子宮和心臟中的胰島素水平比較

2.3 2組大鼠胎盤、子宮和心臟中的GSH和SOD水平比較 與正常妊娠組，GDM組大鼠的胎盤和子宮中GSH和SOD水平都有明顯的下調，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而在心臟組織中，其GSH和SOD水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖3。

2.4 2組大鼠胎盤、子宮和心臟中Nrf2蛋白表達水平的比較 與正常妊娠組比，GDM組大鼠胎盤和子宮中Nrf2蛋白表達水平上調，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而心臟中Nrf2蛋白的表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖4。

3 討論

圖2 2組大鼠胎盤、子宮和心臟中的MDA水平比較

圖3 2組大鼠胎盤、子宮和心臟中的GSH和SOD水平比較

圖4 2組大鼠中胎盤、子宮和心臟中Nrf2蛋白表達水平的比較

GDM的發(fā)病率仍在逐年上升，對母嬰的危害大，但迄今為止，其發(fā)病機制尚不清楚，嚴重限制了該病的早期診斷、病情的監(jiān)控和預后的判斷。GDM患者體內大多存在胰島素抵抗、脂類糖類氧化等代謝異常[2，7]。因此，我們對GDM患病機體的不同組織中氧化應激和胰島素水平進行了深入探討。

氧化應激是指機體在受到有害刺激時，體內高活性分子如活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）和活性氮自由基（reactive nitrogen species，RNS）產生過多，超出了ROS和RNS的清除能力，導致氧化還原系統(tǒng)失衡，從而引起細胞內脂質、蛋白質和核酸的氧化性損傷，最終引發(fā)細胞凋亡和組織器官損傷。為維持機體的氧化還原平衡，當自由基過多時，機體會自發(fā)產生防御反應以清除ROS和RNS。本研究結果顯示，GDM導致胎盤和子宮中的氧化水平明顯提高，且自由基的清除能力明顯減弱，與LAPPAS等[8]的研究結果基本一致，且GDM女性體內產生過量氧自由基的同時，氧自由基的清除能力也會減弱。據(jù)報道，高糖環(huán)境往往會造成氧化損傷，糖尿病長期高糖狀態(tài)導致胰腺組織中抗氧化酶SOD、CAT活性降低，脂質過氧化產物MDA含量增加，ROS生成增多，氧化應激增強[9]。這為后續(xù)深入探討GDM與氧化應激的關系提供了理論基礎。

Nrf2屬于CNC堿性亮氨酸拉鏈轉錄激活因子家族，是調節(jié)體內氧化應激進行自我保護的重要轉錄因子[10]。Nrf2幾乎在所有的組織中都表達，影響Nrf2發(fā)揮作用的主要為Keapl蛋白質[11]。靜息狀態(tài)下，Nrf2因結合Keap1而被抑制活性；當氧化應激時，Keap1與Nrf2分離，Nrf2信號通路被激活，Nrf2轉移到細胞核，與肌腱纖維瘤蛋白結合形成異二聚體，誘導一系列內源性細胞保護基因上調，其中包括抗氧化酶、抗氧化蛋白質、抗炎和解毒的蛋白質，發(fā)揮細胞自我保護作用[11-12]。CHENG等[13]的研究顯示，在子宮的胚胎內皮細胞中，GDM會上調Nrf2的表達，并減低細胞的抗氧化能力。根據(jù)本研究結果，GDM可上調子宮組織中Nrf2的表達水平，推測可能是GDM導致的氧化應激調控了Nrf2的表達。

此外，通過對Nrf2基因敲除鼠和Keap-1基因敲除鼠進行研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2缺失在體內葡萄糖平衡方面有積極的效應，Nrf2激活可減弱胰島素信號通路對葡萄糖的攝取[14-15]，這提示Nrf2可能與促進胰島素抵抗，平衡葡萄糖水平相關。而Nrf2作為核轉錄因子，進入細胞核后，可調控下游相關基因的轉錄。因此，GDM產生胰島素抵抗對Nrf2在轉錄水平上的調控及Nrf2進入細胞核后對下游的氧化應激相關因子表達水平的影響值得進行更深入的研究。

通過比較在胎盤、子宮和心臟中GDM導致的胰島素抵抗、抗氧化水平及Nrf2的表達水平，我們發(fā)現(xiàn)，GDM可導致胎盤和子宮中胰島素水平上升和抗氧化水平下降，并誘導Nrf2的表達水平上升，而并未導致心臟中這三個水平的改變，我們由此得出結論，GDM導致的胰島素抵抗及引發(fā)的抗氧化能力下降和Nrf2的表達上升可能存在明顯的組織差異性。TANG等[16]也指出，GDM導致血清的血清絲氨酸蛋白酶抑制劑水平上調也存在不同組織不同的表型。由此，也明確了GDM發(fā)病機制的特殊性，而GDM對母體不同組織影響的具體分子機制到目前仍沒有進行深入的研究。未來，我們將更進一步地研究GDM中胰島素抵抗、氧化應激和Nrf2表達的關系，并詳細闡明GDM于不同組織中產生的影響。