張瓊敏，李斯斯，陳君，朱翌

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 耳鼻咽喉科，浙江 溫州 325015；2.深圳大學(xué)總醫(yī)院 耳鼻咽喉科，廣東 深圳 518000）

耳聾是困擾人類(lèi)健康的一種常見(jiàn)疾病。全世界范圍內(nèi)每1 000名嬰兒出生就有1～3名聾兒誕生[1]。根據(jù)2006年中國(guó)殘疾人調(diào)查統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)聽(tīng)力言語(yǔ)殘疾者已達(dá)2 780萬(wàn)，其中聽(tīng)力障礙兒童約13.9萬(wàn)，并且每年新生聾兒約3萬(wàn)人[2]。耳聾是兒童語(yǔ)言形成和發(fā)展的巨大障礙，嚴(yán)重影響了患兒身心健康發(fā)育。因此，在嬰幼兒聽(tīng)力篩查的基礎(chǔ)上開(kāi)展耳聾基因檢測(cè)來(lái)防治耳聾是至關(guān)重要的。遺傳和環(huán)境是引起耳聾的兩大主要因素[3]。80%的患者除耳聾外不伴有其他癥狀，稱為非綜合征型耳聾[4]。氨基糖苷類(lèi)藥物性耳聾是一種由氨基糖苷類(lèi)抗生素如鏈霉素、慶大霉素引起的常見(jiàn)的非綜合征型遺傳性耳聾[5]。線粒體12S rRNA基因位點(diǎn)A1555G和C1494T突變是導(dǎo)致該類(lèi)藥物性耳聾最主要的遺傳性基礎(chǔ)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道在嬰幼兒藥物性耳聾患者群體中這兩個(gè)突變位點(diǎn)的發(fā)生率約為11.5%[6]。該兩個(gè)位點(diǎn)的快速有效檢測(cè)對(duì)氨基糖苷類(lèi)藥物性耳聾具有重要的防治意義。目前采集患兒靜脈血進(jìn)行Sanger測(cè)序是檢測(cè)基因突變的金標(biāo)準(zhǔn)[7]。該法技術(shù)成熟，準(zhǔn)確率極高，但費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且血液采集是一項(xiàng)侵入式操作，對(duì)嬰幼兒造成一定程度的痛苦。為縮短檢測(cè)周期并減輕患兒痛苦，本研究嘗試采集患兒口腔黏膜拭子進(jìn)行多重等位基因特異性PCR（multiplex allele-specific PCR，MAS-PCR）來(lái)檢測(cè)A1555G和C1494T的突變，探索一種更為快速、無(wú)創(chuàng)的藥物性耳聾基因檢測(cè)方法。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 收集2015年5月至2017年5月溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻喉科門(mén)診診斷為非綜合征型感音神經(jīng)性耳聾患兒共126例，男65例，女61例，年齡為2～15周歲。入選標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)門(mén)診確診為非綜合征型耳聾、年齡在2～15歲的兒童患者；排除標(biāo)準(zhǔn)：①綜合征型耳聾患者；②有外耳及中耳先天性畸形及病變的患者（聲導(dǎo)抗及耳聲發(fā)射異常）；③有全身性疾病及傳染病的患者。每例患兒采集口腔黏膜拭子3根及靜脈血3 mL，并接受聽(tīng)力學(xué)檢查包括聲導(dǎo)抗、耳聲發(fā)射、測(cè)聽(tīng)[包括小兒電反應(yīng)測(cè)聽(tīng)（2～3周歲）、小兒行為測(cè)聽(tīng)（3～6周歲）、純音測(cè)聽(tīng)（6～15周歲）]等來(lái)判斷是否符合入選標(biāo)準(zhǔn)及評(píng)估聽(tīng)力損傷程度。本研究經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患兒監(jiān)護(hù)人均簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器：Universal Genomic DNA提取試劑盒、TakaRa ExTaq、TakaRa 100 bp plus marker DNA標(biāo)記物、DMSO及質(zhì)粒小量抽提盒；QIAamp DNA minikit（50）試劑盒購(gòu)自德國(guó)QIAGEN生物公司，引物合成由大連寶生物工程有限公司完成，紫外分光光度計(jì)購(gòu)自上海儀電科學(xué)儀器股份公司，PCR擴(kuò)增儀購(gòu)自美國(guó)BioRad公司，DYY-III-8B穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀購(gòu)自北京六一儀器廠，紫外凝膠系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)SynGene公司。

1.2.2 口腔黏膜拭子的采集及口腔脫落黏膜細(xì)胞DNA的提?。喝∑胀ㄡt(yī)用棉簽在患兒口腔頰部刮拭黏膜10次，力度適中，采集拭子3根，干燥處理后置入標(biāo)本袋保存。用QIAamp DNA minikit試劑盒進(jìn)行口腔黏膜脫落細(xì)胞的DNA提取，并用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的濃度及純度。

1.2.3 MAS-PCR：將提取的口腔黏膜脫落細(xì)胞中微量的DNA進(jìn)行MAS-PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)引物設(shè)計(jì)參考文獻(xiàn)[8]。將引物分為2組：N組（C1、N1、N2、C2）和M組（C1、M1、M2、C2）。前者用于檢測(cè)野生型A1555G/C1494T；后者用于檢測(cè)突變型A1555G/C1494T。將微量DNA模板均分成2份，分別進(jìn)行含N組引物的A管PCR反應(yīng)和含M組引物的B管PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系如下：總體積共25 μL，其中含50～100 ng DNA模板、8 pmol引物（M1、M2/Nl、N2）、4 pmol引物（Cl、C2）、1 U Taq酶、1.5 μL 4×d NTP（各0.0025 mol/L）、2.5 μL 10×PCR緩沖液、2.5 μL MgCl2（0.025 mol/L）、4 μL二甲基亞砜。PCR程序設(shè)定：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，63 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，10次循環(huán)（每次循環(huán)退火溫度較上一循環(huán)降低1 ℃）；94 ℃變性40 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35～40次循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。將最終得到的PCR產(chǎn)物在2%濃度的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，經(jīng)溴化乙啶染色后用凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄結(jié)果。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 MAS-PCR瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（bp）

1.2.4 直接測(cè)序法檢測(cè)基因突變位點(diǎn)A1555G及C149AT：采集每位受檢患兒靜脈血3 mL，EDTA抗凝管保存，用Universal Genomic DNA提取試劑盒提取靜脈血中DNA，將獲得的DNA進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物送上海華大基因公司進(jìn)行直接測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用DNASTAR軟件分析比對(duì)并記錄結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。口腔黏膜拭子來(lái)源DNA濃度、純度與靜脈血來(lái)源DNA濃度、純度的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)?？谇皇米觼?lái)源DNA經(jīng)MAS-PCR的檢出率與傳統(tǒng)金標(biāo)準(zhǔn)法檢出率的比較采用kappa一致性檢驗(yàn)。當(dāng)kappa≥0.75表示2種方法檢出率一致性較好；當(dāng)kappa＜0.4表示兩者一致性較差；kappa在0.4與0.75之間時(shí)表示兩者一致性一般；P＜0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2種樣本來(lái)源DNA濃度與純度的比較 口腔黏膜拭子來(lái)源DNA的濃度與靜脈血來(lái)源DNA濃度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；口腔黏膜拭子來(lái)源DNA純度較靜脈血來(lái)源DNA小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

2.2 快速檢測(cè)法檢測(cè)結(jié)果 口腔黏膜拭子來(lái)源DNA進(jìn)行MAS-PCR后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳快速診斷A1555G及C1494T突變情況（見(jiàn)圖1），本研究126例感音神經(jīng)性耳聾患兒中檢測(cè)出A1555G突變者7例，C1494T突變者1例，檢出率為6.35%。

2.3 快速檢測(cè)法與傳統(tǒng)金標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)法檢測(cè)結(jié)果的比較 靜脈血來(lái)源DNA在通過(guò)傳統(tǒng)金標(biāo)準(zhǔn)方法得到的結(jié)果顯示：126例感音神經(jīng)性耳聾患兒中檢測(cè)出A1555G突變者7例，C1494T突變者1例，測(cè)序比對(duì)結(jié)果見(jiàn)圖2，該法檢出率為6.35%。2種方法檢出率的一致性較好（kappa=1，P＜0.01），并且2種方法檢出的陽(yáng)性標(biāo)本為相同患者來(lái)源。

表2 口腔黏膜拭子來(lái)源DNA與靜脈血來(lái)源DNA濃度及純度的比較（

表2 口腔黏膜拭子來(lái)源DNA與靜脈血來(lái)源DNA濃度及純度的比較（

樣本來(lái)源 n DNA濃度（μg/mL）DNA純度（A260/A280）口腔黏膜拭子 126 50.6±23.4 1.70±0.15靜脈血 126 52.5±22.8 1.80±0.12 t-5.73 -4.58 P＜0.001 0.009

圖1 MAS-PCR檢測(cè)患兒藥物性耳聾基因突變電泳圖

圖2 氨基糖苷類(lèi)藥物性耳聾患兒Sanger法基因測(cè)序結(jié)果

2.4 攜帶A1555G及C1494T位點(diǎn)突變患兒的臨床資料回顧分析 對(duì)8例陽(yáng)性結(jié)果患兒臨床病史資料總結(jié)歸納后發(fā)現(xiàn)：7例攜帶A1555G突變患兒中，4例為男童，3例為女童；1例攜帶C1494T突變患兒為女童。他們均來(lái)自偏遠(yuǎn)欠發(fā)達(dá)地區(qū)，出生時(shí)通過(guò)了聽(tīng)力篩查，曾服用氨基糖苷類(lèi)藥物如鏈霉素、慶大霉素等，均為感音神經(jīng)性耳聾，雙耳聽(tīng)力損傷程度為重度到極重度。

3 討論

隨著全面二孩政策的實(shí)施，新生兒數(shù)量的增加，我國(guó)新生聾兒的數(shù)量也日漸增多，防治耳聾的任務(wù)愈顯沉重。新生兒聽(tīng)力篩查已在我國(guó)各大醫(yī)院普遍開(kāi)展[9]。但一部分遺傳性耳聾具有遲發(fā)性或者在環(huán)境因素如藥物的影響下才出現(xiàn)[10]，單純的新生兒聽(tīng)力篩查無(wú)法篩出這部分患兒，這使得耳聾基因檢測(cè)成為新生兒聽(tīng)力篩查的必要補(bǔ)充手段[11]。近年，線粒體基因12S rRNA上A1555G及C1494T位點(diǎn)突變引起的藥物性耳聾成為研究熱點(diǎn)[12-14]。這兩個(gè)突變位點(diǎn)攜帶者在使用氨基糖苷類(lèi)藥物后會(huì)出現(xiàn)不可逆轉(zhuǎn)的感音神經(jīng)性耳聾[15]。如果對(duì)新生兒展開(kāi)A1555G及C1494T位點(diǎn)的檢測(cè)可很大程度上避免該類(lèi)耳聾的發(fā)生[16]，具有重大的防治意義。

目前臨床上對(duì)A1555G及C1494T位點(diǎn)的檢測(cè)主要是通過(guò)抽取患者靜脈血，經(jīng)DNA提取及PCR后將產(chǎn)物送生物公司進(jìn)行Sanger測(cè)序來(lái)完成。該法準(zhǔn)確性極高，但周期長(zhǎng)，費(fèi)用高[17]。另外抽血是一項(xiàng)有侵入性的操作，對(duì)患者尤其是嬰幼兒造成了一定程度的痛苦。為了降低成本，減少痛苦，縮短檢測(cè)周期，本課題組致力于藥物性耳聾基因診斷中標(biāo)本取材及檢測(cè)方法兩方面的探索。關(guān)于耳聾基因檢測(cè)方法，近幾年國(guó)內(nèi)外在基因診斷技術(shù)方面不斷地探索，先后出現(xiàn)了聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性、熒光定量PCR、高效液相色譜分析、高分辨率熔點(diǎn)曲線分析、質(zhì)譜技術(shù)、基因芯片技術(shù)等等[18]，各種不同的基因診斷技術(shù)各有其利弊。本課題組著眼于簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)的優(yōu)勢(shì)，在SCRIMSHAW等[19]的A1555G突變檢測(cè)方法和RODRíGUEZ-BALLESTEROS等[20]的C1494T突變檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上建立了可同時(shí)檢測(cè)A1555G及C1494T突變位點(diǎn)的MAS-PCR技術(shù)，對(duì)靜脈血來(lái)源的DNA可快速準(zhǔn)確地判斷A1555G及C1494T位點(diǎn)的突變情況。而本研究進(jìn)一步嘗試將口腔黏膜拭子來(lái)源的DNA進(jìn)行MAS-PCR，探索簡(jiǎn)便、快速、無(wú)創(chuàng)的藥物性耳聾基因診斷方法。采集汗液、唾液、精液來(lái)獲得取微量DNA在法醫(yī)領(lǐng)域司空見(jiàn)慣[21-23]，臨床上采用口腔黏膜拭子提供DNA來(lái)作為常規(guī)檢測(cè)標(biāo)本卻并不多見(jiàn)。然而一部分特殊群體如嬰幼兒、精神病患者等難以提供靜脈血，此時(shí)無(wú)創(chuàng)的口腔黏膜拭子便可提供另一途徑的標(biāo)本取材[24]。人類(lèi)口腔黏膜細(xì)胞為復(fù)層鱗狀上皮細(xì)胞，具有更新快、易脫落的特點(diǎn)，刮拭口腔頰黏膜可獲得大量脫落細(xì)胞。在本研究中單根口腔黏膜拭子大致可提供800～1 200 ng DNA量，大致與1 mL靜脈血所提取的DNA含量相當(dāng)。而口腔黏膜拭子來(lái)源DNA的純度不及靜脈血DNA，這是由于人類(lèi)口腔中定植了大量的細(xì)菌、病毒等微生物。由此可見(jiàn)，口腔黏膜拭子DNA具有量少，純度不高的特點(diǎn)。根據(jù)模板質(zhì)量的不同MAS-PCR反應(yīng)體系需調(diào)整其中的各影響因素及程序設(shè)定。比較前期已建立的MAS-PCR，本研究中以口腔黏膜拭子DNA為模板的PCR反應(yīng)條件也隨之產(chǎn)生變化。在反應(yīng)體系中，我們?cè)跐舛入A梯式的試探后，適當(dāng)?shù)靥岣吡艘餄舛燃癉MSO濃度并降低了Taq酶、dNTP、及MgCl2的濃度。在程序設(shè)定中，我們?cè)黾恿俗冃?、退火、延伸的循環(huán)次數(shù)。反復(fù)多次調(diào)整后的MAS-PCR有了較高的特異性與穩(wěn)定性，可較清晰地形成預(yù)判結(jié)果的條帶。MAS-PCR在數(shù)小時(shí)內(nèi)便可提供氨基糖苷類(lèi)藥物性耳聾相關(guān)位點(diǎn)A1555G及C1494T突變情況的診斷結(jié)果，較直接測(cè)序法大大地縮短了基因診斷周期，有著明顯的時(shí)間效率優(yōu)勢(shì)。因此應(yīng)用口腔黏膜拭子來(lái)源DNA進(jìn)行多重等位基因特異性PCR可快速、無(wú)創(chuàng)、準(zhǔn)確地檢測(cè)藥物性耳聾基因。

本研究對(duì)象為感音神經(jīng)性耳聾的兒童患者，臨床資料顯示攜帶A1555G及C1494T突變位點(diǎn)的這部分患兒均有氨基糖苷類(lèi)藥物如慶大霉素、鏈霉素的用藥史，而他們均通過(guò)了新生兒聽(tīng)力篩查。本研究探索的通過(guò)MAS-PCR檢測(cè)口腔黏膜DNA藥物性耳聾基因突變位點(diǎn)的方法正是對(duì)新生兒聽(tīng)力篩查的有力補(bǔ)充手段，對(duì)降低氨基糖苷類(lèi)藥物性耳聾發(fā)病率具有十分重要意義。