劉超猛，王梅子，邢文龍，張桂青

（1.石河子大學醫(yī)學院，新疆 石河子 832003；2.石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，新疆 石河子 832008）

創(chuàng)傷后應激障礙（post-traumatic stress disorder,PTSD）為一種與創(chuàng)傷有關，并常伴睡眠損害的疾病[1-2]。褪黑激素被視為生理周期的標志[3]。阿戈美拉汀作為首個褪黑素受體MT1和MT2的激動劑，可以通過修復慢性輕度應激模型大鼠紊亂的晝夜節(jié)律，來減輕PTSD癥狀[3-4]。筆者采用單次延長結合足底電擊應激（single prolonged stress﹠foot shock, SPS&S）模型[5]，在模型復制成功后12 h內給予阿戈美拉汀，探究其對大鼠恐懼、焦慮行為及學習記憶能力減退是否有預防作用。

1 材料與方法

1.1 材料

32只6～8周健康雄性清潔級SD大鼠，體重（180±20）g，購自新疆維吾爾自治區(qū)實驗動物研究中心[動物許可證號：SCXK（新）2016-0001]。12 h晝/夜循環(huán)照明，環(huán)境溫度20～25℃，濕度約為50%，自由進食、飲水。飼養(yǎng)箱內鋪墊適量木材刨花，使大鼠免于不必要的身體傷害，實驗前1周使大鼠適應新環(huán)境，以穩(wěn)定情緒。

1.2 實驗分組

采用2×2析因設計，2個因素為：①SPS&S刺激，即應激，設為因素A；②阿戈美拉汀給藥，即給藥，設為因素B。每個因素各有2個水平：A為應激與否，B為給藥與否。因素與水平全面組合后，隨機等分為空白對照組（不給藥，不應激）、單純應激組（不給藥，應激）、藥物組（給藥，應激）和單純藥物組（給藥，不應激）4組，每組8只。藥物組和單純藥物組通過灌胃給予阿戈美拉汀2.6 mg∕（kg·d），阿戈美拉汀由江蘇豪森藥業(yè)集團有限公司提供（國藥準字H20143375）。該劑量是依據人和大鼠按體表面積折合的等效劑量比值計算而來[6]?？瞻讓φ战M和應激組通過灌胃給予等量生理鹽水，共2周。整個實驗過程嚴格遵循石河子大學動物倫理委員會關于開展實驗動物研究的相關規(guī)定。

1.3 方法

1.3.1 動物模型的復制 依次通過持續(xù)束縛2 h，強制性游泳至大鼠力竭，乙醚麻醉至意識喪失，以及不可逃避的足底電擊復制SPS&S大鼠模型。①持續(xù)束縛是用韌性良好的保鮮膜將大鼠自上而下完全裹緊，再用膠帶封住頭尾兩端，僅在口鼻處留幾個透氣孔以保證大鼠正常呼吸，大鼠頭、軀干及尾巴均不能活動，持續(xù)束縛2 h后去除薄膜，等待2 min。②將大鼠放入一透明立方體游泳箱中（400 mm×300 mm×350 mm），水深300 mm，水溫（22±2）℃。一陣掙扎后（約20 min）大鼠懸停在水面不再動彈，取出擦拭干凈，等待10～15 min。③乙醚麻醉裝置為食品級塑料制成的透明帶小孔的長方形箱子（400 mm×150 mm×150 mm）。將大鼠放入麻醉箱內，均勻傾倒適量99.5%無水乙醚，立刻密封。10 s左右大鼠出現(xiàn)呼吸抑制，不能站立，意識逐漸喪失。將其置于通風良好的籠中，等待大鼠意識恢復。④聲光電箱裝置為一樹脂制成的木質電擊箱，箱體內一側安裝有1個噪音喇叭及1盞聚光燈，底部為導電的金屬細絲[7]。先讓大鼠在無光照環(huán)境適應2 min，再予以10組噪音、聚光、電擊配對的刺激，包括：a.5 s噪音刺激+10 s 8 mA的足底電擊；b.2 s聚光刺激+10 s 8 mA的足底電擊；c.5 s噪音刺激+2 s聚光刺激+10 s 8 mA的足底電擊。每組刺激間隔時間隨機（20～120 s），不應激的大鼠在電擊箱中不通電流，取出后將大鼠放回飼養(yǎng)籠中，不受打擾正常飼養(yǎng)2周。

1.3.2 模型評估 在復制SPS&S大鼠模型6 h內，觀察大鼠的拒縛反應和在Morris水迷宮[8]中的定位航行表現(xiàn)，綜合判斷模型復制是否成功。當實驗人員佩戴專業(yè)手套抓取大鼠脊柱和腹部時，應激大鼠表現(xiàn)出尖叫、回避、掙脫甚至撕咬；而未應激大鼠表現(xiàn)出尋找、試探或者迎合，符合其性情溫順的特征。行Morris水迷宮實驗時，應激的大鼠更多的是圍繞著水迷宮內壁打轉，有類似恐懼、焦慮的反應，或者找到水下平臺的航行距離大大增加；而未應激大鼠總能在規(guī)定時間（設為2 min）找到隱藏在第2象限水下的平臺。見圖1。

圖1 復制SPS&S模型6 h內應激和不應激大鼠在水迷宮中的航行示意圖

1.3.3 條件性恐懼反應 第14天早上將大鼠放入電擊箱中3 min，保持周圍環(huán)境的安靜，不連接電流設備，實驗完成后立刻放回原籠中[9]。用紅外攝像機跟蹤大鼠的高警覺、恐懼表現(xiàn)，并計算其呆滯時間。呆滯表現(xiàn)是指實驗大鼠除呼吸表現(xiàn)出的腹部起伏動作外，觀察不到其他,例如行走、站立或抓撓等行為反應。

1.3.4 曠場實驗 曠場實驗是評價動物自發(fā)活動及焦慮狀態(tài)的經典行為學實驗[10]。曠場實驗箱（900 mm×900 mm×500 mm）底部為16個等大的方格，中央4個為曠場中心區(qū)，其余被看作是邊緣區(qū)。第15天予以曠場實驗，操作流程：①測試前大鼠在箱中適應10 s。②從曠場中間格子開始，在一側白熾燈照明（30 W）下，由頂端的紅外攝像機跟蹤大鼠在曠場15 min內的行為表現(xiàn)。③每只大鼠實驗后用蘸酒精的毛巾擦拭其運動區(qū)域，以防大鼠間產生相互影響。記錄大鼠穿格次數（大鼠以3爪或4爪踏進1個方格）和站立次數（大鼠用后肢支撐，前肢懸空的次數）。

1.3.5 Morris水迷宮實驗 Morris水迷宮裝置將水池等分為4個象限，距離靶象限池壁350 mm處設有一直徑80 mm、高400 mm的圓柱形透明站臺，位于水面上20 mm。池壁內貼有投放大鼠位置的標記物，迷宮正上方設有紅外攝像機，同步記錄大鼠在水迷宮中的表現(xiàn)。①定位航行能力：實驗前從任意方向將大鼠置于站臺上熟悉周邊環(huán)境15 s，隨后隨機將大鼠從非靶象限面壁放入池內。大鼠找到站臺5 s后停止實驗，尋找時間為60 s，若大鼠在規(guī)定時間內找不到站臺，可用鼠棒指引其在站臺適應10 s。將大鼠放入游泳池4次，測定平均上臺潛伏期，以評價大鼠的定位航行力。在模型復制后第16～20天重復以上步驟，除時間上的差別外，實驗方法和大鼠飼養(yǎng)條件相同。②空間探索力：第21天移除靶象限中的站臺，將大鼠面壁放入池內1次，記錄大鼠在迷宮60 s內的表現(xiàn)。主要指標為穿越站臺所在象限次數和第1次到達站臺時間，以評價大鼠的空間探索力。

1.4 統(tǒng)計學方法

數據分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用析因設計的方差分析或重復測量設計的方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 恐懼反應

應激或給藥對電擊箱中大鼠呆滯時間的影響：各組大鼠呆滯時間比較，經析因設計的方差分析，結果：①應激與否大鼠的呆滯時間比較有差別（F=370.915，P=0.000），應激后呆滯時間增多；②給藥與否大鼠呆滯時間有差別（F=72.494，P=0.000），給藥后呆滯時間減少；③應激與給藥存在交互作用（F=58.536，P=0.000）。見表 1。

表1 應激或給藥對大鼠呆滯時間的析因分析（s，±s）

表1 應激或給藥對大鼠呆滯時間的析因分析（s，±s）

給藥應激合計（A因素）是否是41.63±8.14 83.75±11.39 62.69±23.76否11.38±4.00 13.63±2.33 12.50±3.37合計（B因素） 26.50±16.80 48.69±37.07 37.59±30.47

2.2 焦慮行為

2.2.1 應激或給藥對曠場中大鼠跨格次數的影響 各組大鼠跨格次數比較，經析因設計的方差分析，結果：①應激與否大鼠跨格次數有差別（F=36.648，P=0.000），應激后跨格次數減少；②給藥與否大鼠跨格次數有差別（F=19.936，P=0.000），給藥后跨格次數增多；③應激與給藥存在交互作用（F=40.135，P=0.000）。見表2。

2.2.2 應激或給藥對曠場中大鼠站立次數的影響 各組大鼠跨站立數比較，經析因設計的方差分析，結果：①應激與否大鼠站立次數有差別（F=7.077，P=0.013），應激后站立次數減少；②給藥與否大鼠站立次數有差別（F=8.454，P=0.007），給藥后大鼠站立次數增多；③應激與給藥不存在交互作用（F=1.106，P=0.302）。見表3。

表2 應激或給藥對大鼠跨格次數的析因分析（次，±s）

表2 應激或給藥對大鼠跨格次數的析因分析（次，±s）

給藥應激合計（A因素）是否是42.25±6.65 16.38±3.93 29.31±14.37否40.388±7.56 45.88±7.06 43.13±7.61合計（B因素） 41.31±6.94 31.13±16.20 36.22±13.31

表3 應激或給藥對大鼠站立次數的析因分析（次，±s）

表3 應激或給藥對大鼠站立次數的析因分析（次，±s）

給藥應激合計（A因素）是否是13.38±2.67 9.38±2.83 11.38±3.36否15.00±3.07 13.13±2.85 14.06±3.02合計（B因素） 14.19±2.90 11.25±3.36 12.72±3.43

2.3 學習能力

2.3.1 4組大鼠Morris水迷宮上臺潛伏期比較 4組大鼠模型復制后第16、17、18、19和20天的上臺潛伏期比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點的上臺潛伏期有差別（F=54.732，P=0.000）；②4組上臺潛伏期有差別（F=5.523，P=0.004），藥物組與單純應激組相比，上臺潛伏期縮短，相對學習能力提高；③4組上臺潛伏期變化趨勢有差別（F=50.886，P=0.000）。見表4和圖2。

2.3.2 應激或給藥對Morris水迷宮實驗第21天大鼠第1次上臺潛伏期的影響 第21天各組大鼠第1次上臺潛伏期比較，經析因設計的方差分析，結果：①應激與否大鼠第1次上臺潛伏期有差別（F=31.380，P=0.000），應激后第1次上臺潛伏期延長；②給藥與否大鼠第1次上臺潛伏期有差別（F=11.927，P=0.002），給藥后第1次上臺潛伏期縮短；③應激與給藥存在交互作用（F=13.009，P=0.001）。見表 5。

2.3.3 應激或給藥對Morris水迷宮實驗第21天大鼠穿臺次數的影響 各組大鼠跨格次數比較，經析因設計的方差分析，結果：①應激與否大鼠穿臺次數沒有差別（F=3.346，P=0.078）；②給藥與否大鼠穿臺次數沒有差別（F=2.459，P=0.128）；③應激與給藥存在交互作用（F=4.371，P=0.046）（見表6）。典型航行軌跡示意圖見圖3。

表4 各組大鼠不同時間點上臺潛伏期比較 （n =8，s，±s）

表4 各組大鼠不同時間點上臺潛伏期比較 （n =8，s，±s）

組別 16 d 17 d 18 d 19 d 20 d空白對照組 54.14±12.52 51.70±9.12 37.28±18.17 24.19±9.93 16.80±13.42單純應激組 57.18±6.01 50.47±10.48 46.97±9.21 37.00±12.30 36.95±12.44藥物組 57.22±5.11 51.34±8.10 34.13±14.32 26.76±16.36 17.34±9.76單純藥物組 55.45±5.44 51.18±10.90 30.34±11.75 26.43±16.67 17.26±8.76

圖2 各組大鼠上臺潛伏期變化趨勢 （n =8，±s）

表5 應激或給藥對大鼠第1次上臺潛伏期的析因分析（s，±s）

表5 應激或給藥對大鼠第1次上臺潛伏期的析因分析（s，±s）

給藥應激合計（A因素）是否是16.59±11.45 37.26±10.76 26.92±15.14否10.75±2.93 10.30±4.36 10.52±3.60合計（B因素） 13.67±8.62 23.78±16.02 18.72±13.66

表6 應激或給藥對大鼠穿臺次數的析因分析 （次，±s）

表6 應激或給藥對大鼠穿臺次數的析因分析 （次，±s）

給藥應激合計（A因素）是否是4.00±1.07 2.25±1.39 3.13±1.50否3.88±1.46 4.13±1.46 4.00±1.41合計（B因素） 3.94±1.24 3.19±1.68 3.56±1.50

圖3 第21天各組大鼠典型航行軌跡示意圖

3 討論

本研究從PTSD樣大鼠癥狀學的角度出發(fā)，采用國際上公認的SPS&S模型，該模型中既有心理刺激（持續(xù)束縛）又有生理刺激（強制性游泳，乙醚麻醉，不可逃避的足底電擊），可使大鼠真切地體驗到生存環(huán)境中遇到的突發(fā)狀況，與人類遭遇PTSD的情形相似。電擊實驗完成后第14天，筆者依次將4組大鼠放入電擊箱中，而不做任何干預。單純應激組大鼠所表現(xiàn)出的恐懼反應及呆滯行為令人印象深刻，與本課題組董原君等[11]的前期研究結果相似。其中，應激后給藥大鼠相比單純應激大鼠的呆滯時間減少，這不禁讓筆者猜想是阿戈美拉汀消除了PTSD大鼠的部分恐懼與高警覺反應。BANASR等[12]給正常狀態(tài)的Wistar大鼠服用阿戈美拉汀40 mg/（kg·d）3周，發(fā)現(xiàn)其可促進與焦慮相關的齒狀回背側和腹側細胞的增殖，提高整個齒狀回新生神經元的存活率。在本次曠場實驗中，應激后給藥大鼠相對單純應激大鼠來說，穿格次數和站立次數增加，說明單純應激大鼠的自發(fā)運動和焦慮行為得到改善。有研究對阿戈美拉汀治療的成年大鼠的腦片染色發(fā)現(xiàn)，3周后大鼠海馬齒狀回神經元增生顯著增多[13]。因此阿戈美拉汀可能通過調節(jié)大鼠海馬神經元的可塑性，來改善大鼠的學習記憶能力。HAUSCHILDT等[14]研究發(fā)現(xiàn)，當人們表現(xiàn)出創(chuàng)傷后應激障礙癥狀時，其記憶敏感度明顯下降。Morris水迷宮實驗可以很好地檢測大鼠與海馬功能直接聯(lián)系的空間記憶能力[15]。本實驗中，應激后給藥大鼠在Morris水迷宮上臺潛伏期的優(yōu)秀表現(xiàn)足以說明阿戈美拉汀能有效改善SPS&S大鼠的空間記憶能力。特別需要提出的是第21天各組典型航行軌跡。經過5 d的學習，空白對照組和單純藥物組大鼠均能自如地在水迷宮中穿梭，且不止一次地穿越平臺，各組穿臺次數無差異，其原因可能與樣本量較小有關，單純應激組大鼠更多的是漫無目的地圍繞著水迷宮內壁打轉，而藥物組大鼠似乎是在平臺附近努力地尋找，其特征性的表現(xiàn)為筆者下一步要進行的分子機制研究提供了思路。

在生活中，女性罹患PTSD的概率高于男性，在臨床表現(xiàn)和預后等方面也不盡相同[16]。為排除雌性激素對實驗大鼠行為表現(xiàn)的影響，筆者僅復制了雄性動物模型，僅采用一種濃度的阿戈美拉汀，因此其最佳治療劑量也不得而知。盡管如此，本實驗仍提示，阿戈美拉汀很可能是通過調控與記憶、恐懼和焦慮相關的海馬、杏仁核及前額葉等部位的某種信號通路，來發(fā)揮治療作用。受本研究室條件限制，筆者僅從大鼠的行為表現(xiàn)方面論證了阿戈美拉汀對PTSD的預防作用，未進一步深入探討阿戈美拉汀究竟是通過何種作用機制對PTSD的核心癥狀進行干預的。不過可以確定的是，本實驗從行為學的角度證實應激后早期及時給予阿戈美拉汀對預防PTSD有效。