胡玉婷， 段國慶， 凌 俊， 江 河， 侯冠軍

(安徽省農業(yè)科學院水產研究所，安徽合肥 230031)

鱖(Sinipercachuatsi)，又名翹嘴鱖，是馳名中外的名貴淡水經濟魚類，為東亞特有物種，具有十分重要的生態(tài)和經濟價值，主要分布于中國、朝鮮半島、日本等地[1-2]。長期的人工養(yǎng)殖使鱖種質退化嚴重。鑒于養(yǎng)殖鱖抗病力低、耐饑餓程度低、優(yōu)良種苗供應率低等制約因素[3-6]，2008年始研究者利用安徽省內鱖魚資源開展鱖抗耐性目標選育，意外發(fā)現并選擇了體色變異個體(金黃色)進行群體選育，已獲得體色(金黃色)較為穩(wěn)定的遺傳基礎群體。經研究發(fā)現，現有遺傳基礎群體不僅體色變異——金黃色彩，還表現出綜合抗耐性強、相互殘殺低、繁殖性狀好等特征。

目前，關于金色鱖魚選育群體的遺傳背景尚不清楚，細胞色素b(Cytochrome b，Cyt b)是動物線粒體DNA(mtDNA)中結構和功能了解最為清楚的蛋白質基因，具有引物通用性高、長度適宜、進化速率適中等特點，廣泛應用于群體遺傳學及分子系統(tǒng)學等研究[7-9]。研究通過金色鱖魚選育群體與安徽三大水系(長江、淮河及新安江)野生鱖群體比較分析，探討金色鱖魚的遺傳結構及與野生鱖的親緣關系，可為金色鱖魚下一步的選育提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

金色鱖魚樣品采自安徽省滁州市長江水產良種場選育的金色鱖魚群體(30尾)；野生鱖樣品分別采集于安徽長江流域(蕪湖市澛港段，26尾)、淮河流域(鳳臺縣峽山口，29尾)、新安江流域(歙縣深渡段，25尾)。解剖取樣品魚背部肌肉在95%乙醇中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因組DNA提取與PCR擴增、測序

鱖基因組DNA采用生工生物工程(上海)有限公司提供的動物基因組提取試劑盒提取。引物序列為L14724和H15915[10]。PCR擴增體系為：10×buffer(MgCl2)5.0 μL，dNTP(10 mmol /L)4.0 μL，引物(10 mmol/L)各1.5 μL，模板DNA(50 ng/L)2 μL，TaqDNA Polymerase(5 U/μL)0.3 μL，加超純水至50 μL。PCR反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，51 ℃退火35 s，72 ℃延伸45 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸8 min。1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物的長度和濃度合格后，委托生工生物工程(上海)有限公司純化與雙向測序，測序引物同上。

1.3 數據分析

使用軟件Clustal X[11]和Seaview[12]校正、比對序列；DNAsp 5.0[13]計算多態(tài)位點、單倍型數量、單倍型多樣性及核苷酸多樣性；Mega 4.0[14]計算序列堿基組成、變異率、群體間遺傳距離(Kumara 2-parameter距離模型)及構建分子系統(tǒng)樹(NJ-tree)；軟件Network 5.001(http：//www.fluxus-engineering.com/sharenet.htm)繪制單倍型進化網絡圖；Arlequin 3.5[15]計算群體遺傳分化系數(F-statistics，FST)和分子變異分析(analysis of molecular variance，AMOVA)。

2 結果與分析

2.1 序列特征

經比對后，所有鱖樣品的線粒體Cytb同源序列長 1 141 bp，均無堿基插入和缺失，變異位點12個(變異率 0.011%)，包括簡約信息位點7個，單突變位點5個。其中，選育群體無變異位點。堿基平均含量：A(26.1%)、T(28.4%)、G(14.5%)和C(30.9%)，A+T含量(54.5%)顯著高于G+C含量(45.5%)，表現為明顯的堿基組成偏倚性。序列變異主要發(fā)生在三聯密碼子的最后一位，符合蛋白質編碼基因密碼子第3位點進化最快的一般規(guī)律。

2.2 單倍型

4個群體110條Cytb序列包含12種單倍型(表1)，各群體包含單倍型類型及個數差異較大。其中，金色鱖魚選育群體僅包含分布最廣泛的1個單倍型(Hap1)，顯示出極低的遺傳多樣性。野生群體獨有單倍型較多(8個，占比 66.7%)，其中僅包含1個樣品的單倍型6個。群體間共有單倍型較少，僅有4個，但包含樣品數較多(90.0%)。所有群體均含有的單倍型(Hap1)包含71個樣品(出現率64.5%)；另有3種單倍型(Hap5、Hap7、Hap8)分別為2個群體共有，包含樣品數分別為10、6、12個。

表1 鱖單倍型的分子系統(tǒng)樹及其群體分布

注：J、H、C和X分別代表金色鱖魚、淮河、長江和新安江鱖魚群體，下同。

由表1、圖1可知，各群體單倍型的分布表現出一定的地理結構，它們以Hap1為中心向外輻射，其余單倍型均可由Hap1經1～4個堿基置換而得。野生群體中，長江群體介于淮河和新安江之間，表現為兩者的過渡。

2.3 遺傳多樣性

由表2可知，鱖魚各群體單倍型多樣性普遍較高(0.609 2～0.665 0)，核苷酸多樣性偏低(0.000 00～0.001 26)。其中，金色鱖魚選育群體單倍型多樣性和核苷酸多樣性均最低；淮河群體單倍型多樣性和核苷酸多樣性均最高。三野生群體的遺傳多樣性大致在同一水平，鱖魚長江群體單倍型多樣性略低、新安江群體核苷酸多樣性略低。

2.4 遺傳結構

由表3可知，群體間平均遺傳距離較大(0.00074～0.001 48)，尤其新安江群體與所有群體間的遺傳距離均較大(0.001 31～0.001 48)，其中淮河群體與新安江群體間遺傳距離最大。群體間遺傳分化系數FST值(0.091 74～0.537 43)均明顯大于0.05，且有極顯著差異(P<0.001)。

表2 鱖群體的遺傳多樣性參數

表3 鱖群體間遺傳距離(對角線上)和遺傳分化

注：所有FST值P<0.001。

分子變異分析(AMOVA)結果顯示，來自群體間遺傳變異為21.64%，群體內變異為78.36%(P<0.001)；表明4個群體間產生了一定程度的遺傳分化。

表4 鱖群體間分子變異分析(AMOVA)

基于群體間遺傳距離矩陣構建的群體間分子系統(tǒng)樹(NJ-tree)見圖2。由圖2可知，與單倍型系統(tǒng)樹、單倍型進化網絡圖結果類似，選育群體與淮河群體親緣關系更近，長江群體介于淮河群體與新安江群體之間。

3 討論

3.1 遺傳多樣性

遺傳多樣性是物種適應環(huán)境變化所必需的，是生物進化的物質基礎。種內遺傳多樣性是一個物種對外界干擾能否成功反應的決定性因素。種群內的遺傳多樣性反映了物種的進化潛力，物種的遺傳變異越豐富，對環(huán)境的適應性越廣[16]。由于親本基數較少、近親繁殖和遺傳漂變等因素影響，人工養(yǎng)殖的水產動物的群體遺傳多樣性一般低于野生群體[17-19]；而育種群體的遺傳多樣性隨選育進程逐漸下降，后代群體表現為更低的遺傳多樣性水平[20-23]。研究結果顯示，野生鱖魚群體的遺傳多樣性大致在同一水平，單倍型多樣性(Hd)較高、核苷酸多樣性(Pi)較低；選育群體的單倍型多樣性(Hd)和核苷酸多樣性(Pi)均遠低于野生群體，尤其是選育群體30個樣品中未見任何線粒體Cytb遺傳變異，Hd和Pi極低。這是由于金色鱖魚的第一代個體數量特別少，而歷代選擇繁育的親本(體色較黃)基數也小，選擇壓力低，使其后代保持了非常低的遺傳多樣性水平。

盡管如此，研究中發(fā)現金色鱖魚表現出許多較好的經濟性狀(綜合抗耐性強、相互殘殺低、繁殖性狀好等特征)，這說明其尚未出現種質衰退的狀況。這是因為線粒體Cytb基因的變異與上述這些經濟性狀相關基因無相關關系?？紤]到試驗選取的樣品數有限，且使用了單一的僅母系遺傳的分子標記，金色鱖魚選育群體及其后代的遺傳多樣性狀況還需要更加全面和深入的研究。

3.2 鱖群體的遺傳結構

安徽地跨長江、淮河、新安江三大水系，是我國鱖魚資源生態(tài)優(yōu)勢區(qū)，既是鱖魚資源的天然基因庫，又是鱖魚的傳統(tǒng)養(yǎng)殖區(qū)。金色鱖魚選育群體在各地方群體相互交配的育種過程中被發(fā)現。群體間系統(tǒng)進化樹結果顯示，金色鱖魚選育群體與淮河群體鱖魚親緣關系更接近；但選育群體的唯一單倍型(Hap1)在三大水系野生群體中均為優(yōu)勢單倍型；說明單倍型1分布十分廣泛，由于選育群體的親本個體較少，難以就此確定其母系來自哪個群體。

遺傳分化系數(FST)用于衡量群體間遺傳分化程度，其值大小代表群體分化程度的高低，FST為0.00～<0.05、0.05～<0.15、0.15～<0.25時分別被認為無分化、中度分化和高度分化[24]。研究中群體間FST值(0.091 74～0.537 43)均大于 0.05(P<0.001)，表明各群體間存在一定程度的遺傳分化。野生群體間，基于單倍型分子系統(tǒng)樹和簡約進化網絡圖的結果均顯示，長江群體處于淮河群體與新安江群體的過渡，這與各野生群體所處地理位置相關。這種遺傳距離隨地理距離而變化的特征在許多魚類親緣地理學研究中普遍存在[25-26]。