滕 龍 洪 芳 何建成#

1 浙江醫(yī)院 浙江 杭州310013 2 上海中醫(yī)藥大學(xué) 上海 201203

帕金森?。≒D）是一種神經(jīng)變性疾病，由于黑質(zhì)-多巴胺（DA）能神經(jīng)元變性、壞死，導(dǎo)致黑質(zhì)-多巴胺能神經(jīng)元受損，引起直接通路-間接通路失調(diào)是其主要發(fā)病機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)基于前期研究，通過(guò)檢測(cè)大鼠腦內(nèi)γ-氨基丁酸（GABA）受體和N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體相關(guān)基因表達(dá)的變化，探索熟地黃治療PD及左旋多巴誘導(dǎo)異動(dòng)癥（LID）的“增效減毒”機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及條件：SPF級(jí)SD大鼠，雄性，120只，體重180～200g，由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SCXK（滬）2012-0002]。動(dòng)物飼養(yǎng)在上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，恒溫23±2℃，相對(duì)濕度60%～65%，動(dòng)物攝食、飲水及活動(dòng)自由。無(wú)菌手術(shù)在上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行[SYXK（滬）2014-0008]，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道關(guān)懷。

1.2 實(shí)驗(yàn)主要試劑、藥物及儀器：Trizol Reagent（Invitrogen公司）；Reverse Transcription System（Promega公司）；焦碳酸二乙酯（DEPC）（Sigma公司）；GoT-aq? qPCR Master Mix（Promega公司）；氯仿（上海試一化學(xué)試劑有限公司）；引物合成（上海生工）；熒光定量PCR儀：ABI 7500型；RNA/DNA calculator（Pharmacia公司）；高速冷凍離心機(jī)（BECKMAN公司）；6-hydroxydopamine（6-OHDA）、阿撲嗎啡（APO）、抗壞血酸、左旋多巴干粉、芐絲肼，均為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；大鼠腦立體定位儀：TOW-3A型。熟地黃濃度為5.18g/ml，由上海雷允上藥材有限公司代加工。大鼠中藥的每日用量按孫瑞元[1]方法計(jì)算。

1.3 LID大鼠模型制備：采用Ungerstedt等[2]創(chuàng)立的方法。術(shù)前按常規(guī)進(jìn)行行為測(cè)試，確認(rèn)無(wú)異常旋轉(zhuǎn)行為后，用3%戊巴比妥鈉50mg/kg腹腔注射麻醉。然后將大鼠固定于腦立體定位儀上，頭部去毛，苯扎溴銨常規(guī)消毒。無(wú)菌條件下，沿正中線切開大鼠顱頂皮膚，剝離骨膜，暴露前囟。以前囟為準(zhǔn)，據(jù)包新民等[3]著大鼠腦立體定位圖譜，確定右側(cè)黑質(zhì)二坐標(biāo)：①前囟后5.2mm，正中線右側(cè)1.0mm，硬膜下9.0mm。②前囟后5.2mm，正中線右側(cè)2.5mm，硬膜下8.5mm。用顱骨鉆于手術(shù)要求部位小心鉆開顱骨，用5μl微量進(jìn)樣器將6-OHDA（溶于含0.2%維生素C的生理鹽水中，即稱量藥品抗壞血酸0.001g，溶于生理鹽水0.5ml中）注入右側(cè)黑質(zhì)部（以1.0mm/min速度緩慢進(jìn)針），每孔3μl，注射速度1μl/min，注射完后留針5min，然后以1.0mm/min速度緩慢退針。手術(shù)完成后，用醫(yī)用明膠海綿填塞顱骨孔，縫合切口皮膚，肌肉注射慶大霉素7d，待動(dòng)物清醒后放回飼養(yǎng)籠中飼養(yǎng)。假手術(shù)組也按上述方法操作，但只注射0.2%維生素C的生理鹽水，正常對(duì)照組只捆綁動(dòng)物，不作任何處理。10d后，以腹腔注射APO 0.5mg/kg誘發(fā)大鼠向一側(cè)旋轉(zhuǎn)，記錄開始旋轉(zhuǎn)至30min內(nèi)的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)，以旋轉(zhuǎn)圈數(shù)平均＞7次/min者為合格PD模型[4]。將成功PD模型大鼠予腹腔注射左旋多巴+芐絲肼（50mg/kg左旋多巴和12.5mg/kg芐絲肼），每日2次，連續(xù)2周。正常對(duì)照組、假手術(shù)組予腹腔注射等量的含0.05%乙醇和0.1%抗壞血酸的注射用水，每日2次，連續(xù)2周。2周后,誘發(fā)動(dòng)物具有典型不自主動(dòng)作（AIM）表現(xiàn)（AIM評(píng)分＞20），且APO誘導(dǎo)大鼠對(duì)側(cè)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)增加者，為成功LID模型大鼠[4]。

1.4 分組及給藥：采用區(qū)層隨機(jī)法，將成功的LID模型大鼠分為4組，LID 4周、6周模型組及熟地黃4周、6周組，每組各8只。另取正常對(duì)照4周、6周組、假手術(shù)4周、6周組，每組各8只。LID模型組大鼠在腹腔注射左旋多巴+芐絲肼（50mg/kg左旋多巴和12.5mg/ml芐絲肼）基礎(chǔ)上予生理鹽水灌胃；熟地黃組大鼠在腹腔注射左旋多巴+芐絲肼基礎(chǔ)上予中藥熟地黃湯灌胃；正常對(duì)照組、假手術(shù)組予腹腔注射等量含0.05%乙醇和0.1%抗壞血酸的注射用水基礎(chǔ)上給予生理鹽水灌胃。每次灌胃量為2ml，每日1次，分別連續(xù)用藥4周、6周。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：所有資料均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用SPSS16.0軟件進(jìn)行齊性檢驗(yàn)并做t檢驗(yàn)和方差分析。P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LID模型大鼠紋狀體內(nèi)GABA-RB1基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化及熟地黃干預(yù)作用：見表1。

表1 LID模型大鼠紋狀體內(nèi)GABA-RB1基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化及熟地黃干預(yù)作用（±s）

表1 LID模型大鼠紋狀體內(nèi)GABA-RB1基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化及熟地黃干預(yù)作用（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.001；與假手術(shù)組比較，#P＜0.001；與LID模型組比較，&P＜0.001。

正常對(duì)照組假手術(shù)組LID模型組熟地黃組8 8 8 8 1.065±0.086 0.851±0.150 0.204±0.009*#0.414±0.023*#&0.845±0.138 0.684±0.127 0.131±0.015*#0.422±0.025*#&

2.2 LID模型大鼠紋狀體內(nèi)NMDA-R1和NMDA-R2基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化及熟地黃干預(yù)作用：見表2。

表2 LID模型大鼠紋狀體內(nèi)NMDA-R1和NMDA-R2基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化及熟地黃干預(yù)作用（±s）

表2 LID模型大鼠紋狀體內(nèi)NMDA-R1和NMDA-R2基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化及熟地黃干預(yù)作用（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；與假手術(shù)組比較，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001；與LID模型組比較，&P＜0.001；與4周組比較，△P＜0.01，△△P＜0.001。

正常對(duì)照組假手術(shù)組LID模型組熟地黃組8 8 8 8 0.030±0.006 0.030±0.003 0.112±0.009***###0.058±0.004***###&0.031±0.003 0.030±0.002 0.167±0.012***###△△0.061±0.004***###&0.915±0.105 0.827±0.092 2.146±0.302***###1.111±0.132*#&0.928±0.168 0.992±0.103 2.430±0.183***###△1.252±0.258**##&

3 討論

根據(jù)臨床癥狀，PD屬中醫(yī)學(xué)“顫證”范疇，前期我們通過(guò)梳理與挖掘文獻(xiàn)，總結(jié)出PD是以肝腎陰虧,臟腑功能失調(diào)為本，風(fēng)、痰、瘀、毒互結(jié)蘊(yùn)塞腦竅為標(biāo)的本虛標(biāo)實(shí)之證[5]。由此確立治療大法以滋補(bǔ)肝腎為主。我們將滋補(bǔ)肝腎、養(yǎng)血益精的熟地黃作為治療用藥。如《景岳全書》曰：“陰虛而神散者，非熟地之守，不足以聚之；陰虛而躁動(dòng)者，非熟地之靜，不足以鎮(zhèn)之；陰虛而剛妄者，非熟地之甘，不足以緩之?！?/p>

廣泛存在于腦內(nèi)的氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)，按其對(duì)突觸后神經(jīng)元的不同作用，可分為興奮性氨基酸（EAA）和抑制性氨基酸（IAA）。NMDA受體是存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的一類重要的EAA受體，到目前為止已克隆出5個(gè)亞基：NMDA-R1、NMDA-R2（A-D）。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大鼠腦內(nèi)的NMDAR1和NMDA-R2基因表達(dá)，LID模型組與正常對(duì)照組、假手術(shù)組相比有顯著上調(diào)趨勢(shì)，LID 6周組與LID 4周組相比也有上調(diào)趨勢(shì)，說(shuō)明大量EAA受體（主要是NMDA受體）過(guò)度激活后，可能會(huì)引起神經(jīng)元凋亡。左旋多巴的長(zhǎng)期應(yīng)用可能與興奮性毒性的過(guò)度堆積有關(guān)。熟地黃干預(yù)后，NMDA-R1、NMDA-R2基因表達(dá)較LID模型組相比較呈降低趨勢(shì)，說(shuō)明熟地黃可以顯著改善興奮性氨基酸蓄積產(chǎn)生的興奮性毒性，緩解帕金森病異動(dòng)癥的癥狀。γ-氨

基丁酸（GABA）是主要的抑制性氨基酸（IAA）。有研究表明，紋狀體內(nèi)的GABA對(duì)調(diào)節(jié)基底神經(jīng)節(jié)-丘腦-皮層環(huán)路的興奮-抑制平衡發(fā)揮重要的作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，LID模型與正常對(duì)照組、假手術(shù)組相比，大鼠腦內(nèi)GABA-RB1基因表達(dá)有顯著下調(diào)趨勢(shì)；LID 6周組與LID 4周組相比，大鼠腦內(nèi)GABA-RB1基因表達(dá)也有下調(diào)趨勢(shì)。熟地黃干預(yù)后，GABA-RB1基因表達(dá)較LID模型組相比，呈升高趨勢(shì)，說(shuō)明熟地黃可能通過(guò)升高抑制性氨基酸相關(guān)基因的表達(dá)而緩解LID的癥狀。